Regulation des Calcium-Signalwegs an einem sekretorischen Epithel

Abstract

Der Na+/Ca2+-Austauscher ist ein wichtiger Regulator der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Am Kolonepithel ist dieses Carrier-Protein bereits funktionell nachgewiesen worden. Mittels PCR war es möglich einen molekularbiologischen Nachweis über die Existenz des Na+/Ca2+-Austauschers in Kolonkrypten zu führen. Fura-2-Experimente gaben den Hinweis, dass der Austauscher über den Füllungszustand intrazellulärer Ca2+-Speicher reguliert wird. Mit Hilfe der Mangan-Quench-Methode wurde dies widerlegt, gleichzeitig wiesen die Ergebnisse dieser Versuche darauf hin, dass an Kolonkrypten ein positiver Feedback-Mechanismus für Ca2+ existiert. Solch ein Mechanismus wird als Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung (CICR) bezeichnet; Ca2+-sensitive Ca2+-Rezeptoren an den intrazellulären Ca2+-Speichern (Ryanodinrezeptoren) sind verantwortlich für die Ca2+-Freisetzung. Sowohl durch Fura-2 als auch durch Ussingkammer-Experimente konnte im Kolonepithel ein Ryanodinrezeptor funktionell nachgewiesen werden. Ryanodin, ein pharmakologischer Agonist an diesen Rezeptoren, zeigte in Fura-2-Experimenten einen konzentrationsabhängigen Effekt. In Fura-2-Experimenten bewirken Konzentrationen zwischen 10-7 und 3.10-4 mol.l-1 einen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Spiegels wenn sie kumulativ appliziert werden. Wird die höchste Konzentration alleine verabreicht ist kein Ca2+-Anstieg beobachtet; es scheint eine Hemmung des Ryanodinrezeptors vorzuliegen. Zyklische ADP-Ribose (10-5 mol.l-1) wirkt als intrazellulärer Botenstoff ebenfalls agonistisch am Ryanodinrezeptor und bewirkte in isolierten Kolonkrypten einen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Spiegels. Die Wirkung beider Agonisten konnte durch den Ryanodinrezeptorblocker Ruthenium Rot (5.10-5 mol.l-1) unterdrückt werden. Auch das Methylxanthin Koffein, dass generell als Agonist des CICR angesehen wird, löste an isolierten Kolonkrypten einen Anstieg des intrazellulären Ca2+ aus. In Ussingkammer-Experimenten konnte Ryanodin einen konzentrationsabhängigen Anstieg des Kurzschlussstroms bewirken, was einen weiteren Beweis für die Existenz eines Ryanodinrezeptors darstellt. Um die physiologische Bedeutung des Ryanodinrezeptors für das Kolonepithel zu ermitteln, wurde in Ussingkammer-Experimenten durch Carbachol (5.10-5 mol.l-1) eine Ca2+-abhängige Cl--Sekretion induziert. Wurde gleichzeitig der Ryanodinrezeptor inhibiert, entweder durch Ruthenium Rot (5.10-4 mol.l-1) oder hochkonzentriertes Ryanodin (10-3 mol.l-1), war die Cl--Sekretion deutlich reduziert. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine positive Rückkopplung im Sinne eines CICR an der Aufrechterhaltung der Ca2+-abhängige Cl--Sekretion beteiligt ist. The Na+/Ca2+-exchanger is one of the most important regulators of the intracellular Ca2+ homeostasis. For the colonic epithelium the existence of a Na+/Ca2+-exchanger has already been proven functionally. Using the PCR-method it was possible to verify this on the molecular level. Fura-2 experiments pointed out that the exchanger might be regulated by the filling state of the intracellular Ca2+-stores. By dint of the Manganese quench method this hypothesis was vitiated. The results of the quench studies also gave a hint for the existence of a positive feedback mechanism for Ca2+, which is referred to as a Ca2+-induced Ca2+-release (CICR). Fura-2 as well as Ussing chamber experiments gave evidence for the functional expression of ryanodine receptors in the rat colonic epithelium. Ryanodine, a pharmacological agonist on these receptors, showed a concentration-dependent effect in Fura-2 studies. Ryanodine concentrations between 10-7 and 3.10-4 mol.l-1 caused an increase in the intracellular Ca2+ level, when administered cumulatively. However, when the highest concentration was administered alone, no rise in the intracellular Ca2+ concentration could be observed, suggesting an inhibition of the receptor. Cyclic ADP ribose (10-5 mol.l-1) is an intracellular messenger which acts as a stimulator of the CICR. At isolated colonic crypts cADP ribose induced a rise in the intracellular Ca2+ concentration. The effect of both agonists was suppressed by ruthenium red, a blocker of ryanodine receptors. The methylxanthine coffein is generally accepted to act as an agonist of CICR. In Fura-2 studies it induced also a rise in the intracellular Ca2+ level of colonic crypts. In Ussingchamber experiments ryanodine evoked a concentration-dependent increase in short circuit current, giving a further hint for the existence of ryanodine receptors in the colonic epithelium. To investigate the physiological relevance of ryanodine receptors in this tissue, a Ca2+-dependent Cl--secretion was induced by carbachol (5.10-5 mol.l-1). If the ryanodine receptor was inhibited simultaneously either by ruthenium red (5.10-4 mol.l-1) or high-concentrated ryanodine (10-3 mol.l-1), the chloride secretion was clearly diminished, suggesting a physiological involvement of the ryanodine receptor in Ca2+-dependent Cl--secretion.