Charakterisierung ionotroper purinerger Rezeptoren im Nucleus arcuatus des Rattengehirns

Abstract

Der Nucleus arcuatus (ARC) des Hypothalamus spielt eine wichtige Rolle im Rahmen der neuroendokrinen Kontrolle der Adenohypophyse sowie der zentralen Homöostase des Energiehaushaltes bei Säugetieren. Neurone und Gliazellen des ARC sind aufgrund der lokal durchlässigen endothelialen Blut-Hirn Schranke für zirkulierende Hormone des Energiestoffwechsels erreichbar. An der Integration afferenter neuronaler und humoraler Signale im Bereich des ARC scheint neben Glutamat, GABA sowie zahlreichen Neuropeptiden auch neuronal synthetisiertes ATP als purinerger Neuromodulator beteiligt zu sein. So liegen für den ARC von Maus und Ratte erste Hinweise auf eine funktionelle Expression purinerger P2-Rezeptoren vor. Diese lassen sich in zwei "Familien" einteilen: die ionotropen P2X-Rezeptoren (P2X1 - P2X7) sowie die metabotropen P2Y-Rezeptoren. Im Rahmen der Promotionsarbeit erfolgte daher eine detaillierte Charakterisierung ionotroper P2X-Rezeptoren im ARC der Ratte anhand einer de novo zu etablierenden neuroglialen Primärzellkultur dieses Kerngebietes. Die mittels immunzytochemischer Markierungen in Neuronen der ARC-Primärkultur aus neonatalen Rattengehirnen aufgezeigte Expression ARC-spezifischer Neuropeptide [Proopiomelanocortin (=POMC), Neuropeptid Y (=NPY), Neurotensin (=NT), Somatostatin] und deren Kolokalisation mit Tyrosinhydroxylase (TH) spiegelt das typische Transmitter coding für den ARC adulter Ratten wieder. Zudem konnte der immunzytochemische Nachweis des P2X2-Purinozeptors (P2X2R) in Neuronen und des P2X4R in Mikrogliazellen der ARC-Primärzellkultur demonstriert werden. Auf mRNA-Ebene ermöglichte die qRT-PCR Analyse den Nachweis für die Expression von P2X2R, P2X4R, P2X6R sowie eingeschränkt P2X3R in der Primärkultur. Kompetitive Verdrängungsstudien an einer isolierten Plasmamembranfraktion des Hypothalamus sowie semiquantitative autoradiographische Studien auf der Ebene des ARC adulter Ratten, unter Benutzung des purinozeptorspezifischen Radioliganden [35S]dATP& #945;S sowie unmarkierter P2XR-Agonisten und -Antagonisten, ergaben Hinweise auf die Expression der Subtypen P2X2R, P2X3R und P2X7R für den Gesamthypothalamus respektive P2X2R und/oder P2X3R für den ARC.Die pharmakologische Charakterisierung der P2X-Rezeptorsubtypen einzelner Neurone und Astrozyten der ARC-Primärkultur erfolgte durch die mikrospektrofluorimetrische Analyse (Fura-2) der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]iz). Beide Zelltypen zeigten bei Superfusionsstimulation mit den Purinozeptoragonisten ATP bzw. 2-MeSATP transiente intrazelluläre Kalziumsignale. Es wurden Versuchsreihen durchgeführt zur Ermittlung: [1] einer Dosis-Wirkungsbeziehung (nachweisbar), [2] möglicher Desensibilisierungseffekte bei repetitiver Stimulation (Einteilung der Zellen in zwei Gruppen), [3] der Bedeutung von extra- vs. intrazellulärem Kalzium für die Signale (Unterschied zwischen Neuronen und Gliazellen), sowie [4] des Einflusses der Inkubationstemperatur. Durch den Einsatz subtypspezifischer Agonisten (BzATP, alpha,beta-meATP) sowie generalisierter P2R- (Suramin, PPADS) und subtypspezifischer P2XR-Antagonisten (RB-2, TNP-ATP, PSB-1011) in Suppressionsexperimenten konnte die funktionelle Expression ionotroper Purinozeptoren mit P2X2R-ähnlichen Charakteristika in neuropeptidergen (POMC, NPY, NT) bzw. dopaminergen Neuronen sowie Astrozyten der ARC-Primärkultur postuliert werden.Auf Grund der Resultate der qRT-PCR, der Immunzytochemie sowie vor allem der detaillierten pharmakologischen Charakterisierung funktionell exprimierter P2X-Rezeptoren kann für Neurone und Astrozyten des ARC die Prävalenz eines funktionellen P2X2-Purinozeptors postuliert werden. The arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus plays an important role in the central control of energy homeostasis and adenohypophyseal neuroendocrine function in mammals. Neurons and glial cells of the ARC are accessible to circulating hormones involved in the control of energy metabolism due to the locally permeable endothelial blood-brain barrier. Besides glutamate, GABA as well as numerous neuropeptides, neuronally synthesized ATP, as a purinergic neuromodulator, is apparently involved in the integration of afferent neuronal and humoral signals in the area of the ARC. First evidence for a functional expression of purinergic P2 receptors has been provided in the ARC of rats and mice. Purinergic P2 receptors are divided into two families: the ionotropic P2X receptors (P2X1 - P2X7) as well as metabotropic P2Y receptors. Therefore, the aim of the present PhD thesis was to undertake a detailed characterization of ionotropic P2X receptors in the ARC of the rat on the basis of a de novo establishment of a primary neuroglial cell culture of the hypothalamic ARC. Employing immunocytochemical double-labeling techniques, it was possible to demonstrate the distinctive expression of ARC-specific neuropeptides (proopiomelanocortin (=POMC), neuropeptide Y (=NPY), neurotensin (=NT), somatostatin) as well as their co-localization with tyrosine hydroxylase (TH) in neurons of the ARC primary cell culture prepared from rat pup brains. Additionally, these cells distinctly reflect the in situ state of the ARC in the brain of the adult rat. The immunocytochemical identification of the purinoceptor subtype P2X2 (P2X2R) was demonstrated in numerous neurons of the ARC primary cell culture as was the identification of P2X4 exclusively in microglial cells. At the mRNA level, qRT-PCR analysis provided the confirmation for expression of P2X2R, P2X4R, P2X6R and to a limited extent P2X3R in the primary cell culture. Competitive displacement studies on isolated plasma membrane fractions of the whole hypothalamus as well as semiquantitative autoradiographic studies on the ARC level show evidence for the expression of P2X2R, P2X3R and P2X7R throughout the whole hypothalamus as well as P2X2R and/or P2X3R in the ARC of adult rats as a result of effective displacement of the radioactive purinoceptor ligand [35S]dATPαS by unlabeled P2XR agonists and antagonists. The pharmacological characterization of P2X receptor subtype expression in individual neurons and astrocytes was carried out by microspectrofluorimetric determination of intracellular calcium concentration ([Ca2+]ic) - using the Fura-2 ratio imaging technique. With regard to superfusion with the purinoceptor agonists ATP respectively 2-MeSATP, both cell types demonstrated transient calcium signals. Experimental series were performed to determine: [1] dose-response relationships (verifiable), [2] potential desensitization during repetitive stimulation (classification of cells into two groups), [3] relevance of extra- vs. intracellular calcium for these signals (difference between neurons and glial cells) as well as [4] the influence of the incubation temperature.Superfusion stimulation experiments in the presence of specific agonists (BzATP, alpha,beta-meATP), respectively general (suramin, PPADS) and subtype-specific P2XR antagonists (RB-2, TNP-ATP, PSB-1011) allowed to postulate the functional expression of ionotropic purinoceptors with P2X2-like characteristics in neuropeptidergic (POMC, NPY, NT) or dopaminergic neurons and also in astrocytes of the ARC-specific primary culture.Based on the results of the qRT-PCR, the immunocytochemistry and primarily the detailed pharmacological characterization of functional expressed P2X receptors, a prevalence of a functional P2X2 purinoceptor in neurons and astrocytes of the ARC can be postulated.