Tracking adenovirus infections in reptiles

Abstract

The purpose of this project was to screen reptiles for the presence of adenovirus (AdV) infection, develop serological tests for the detection of antibodies against AdVs in squamate reptiles and to examine the serological relationships between lizard and snake AdVs, helping to ensure the establishment and maintenance of healthy populations. An additional aim of the project was the establishment of an agamid cell line and isolation of adenoviruses from bearded dragons (Pogona vitticeps).A PCR targeting the DNA-dependent DNA polymerase gene was used for screening as described previously. PCR led to the detection of AdVs in 10.6% of lizards, 6.2% of snakes, and 4.2% of chelonians tested. Ten new AdVs, were detected during this study. New AdVs were found in green striped tree dragons (Japalura splendida), a green anole (Anolis carolinensis), a Jackson s chameleon (Chamaeleo jacksonii), a common agama (Agama agama) and a Hermann s tortoise (Testudo hermanni). These demonstrated less than 80% aa sequence identity of a portion of the DNA-polymerase gene to previously described AdVs. An AdV detected in a water monitor (Varanus salvator) had less than 90% sequence identity with a previously described AdV. Viruses demonstrating less than 99% sequence identity to previously described viruses were detected in a boa constrictor (Boa constrictor), a pond slider (Trachemys scripta), an Alabama map turtle (Graptemys pulchra) and in a blue tree monitor (Varanus (Euprepiosaurus) macraei). Phylogenetic analysis demonstrated that all of the AdVs detected in squamates, except Varanid AdVs, cluster within the genus Atadenovirus. However, all of the Varanid AdVs described so far cluster outside of the currently accepted genera. All chelonian AdVs detected during this study cluster in the proposed genus Testadenovirus .For the isolation of AdVs from bearded dragons, a cell line was established from whole 6 8 week old central bearded dragon embryos. This cell line has been used with samples from AdV PCR-positive bearded dragons. Eleven AdV isolates were obtained during this study on BDE cells. All isolates have been serially passaged on the established BDE cells. The AdVs isolated in BDE cells were identified as AdVs by PCR amplification and sequencing of a portion of the DNA-dependent DNA polymerase gene and showed 99-100% nucleotide identity to the corresponding region of Agamid AdV-1 (DQ077706). Two isolates were also identified as AdVs by electron microscopic examination of the cell culture supernatants. Polyclonal antibodies against Helodermatid AdVs-1 and -2 were raised in rabbits and used to establish neutralization tests with AdVs isolated during this study. Helodermatid AdVs-1 and -2, Snake AdVs-1 and -2 and an Agamid AdV-1 isolated in BDE during this study were used to detect neutralizing antibodies in plasma from a total of 404 reptiles. In lizards and snakes, antibodies were most commonly detected against Agamid AdV-1. The majority of helodermatid lizards tested had antibodies against Helodermatid AdV-2; antibodies against Agamid AdV-1 and Helodermatid AdV-1 were also present. Antibodies against Agamid AdV-1 were most commonly detected in agamid lizards. Three lizards (one helodermatid and two agamid lizards) had antibodies against Snake AdV-1. Antibodies against Helodermatid AdV-2 were also detected in snakes. No antibodies against Helodermatid AdV-1 were found in any of the snakes tested. The majority of viperid snakes had antibodies against Agamid AdV-1, while antibodies against the other isolates were less common in these animals. Antibodies against Agamid AdV-1 were also the most commonly detected antibodies in python samples.The serological studies demonstrate that AdV infections appear to be common in wild-caught and captive lizards and snakes. The pattern of reactivity found in snakes and lizards against this range of squamate atadenoviruses shows that these viruses may not be as species specific as previously supposed. Hence, it is possible that these viruses may be able to spread between various squamate species. The results of this study show that AdV infections are common among reptiles and increase our understanding of genetic diversity among these viruses. They also further confirm the usefulness of a pan-AdV PCR for the detection of AdVs in reptiles including both squamates and chelonians. In addition, this is the first report on the detection of antibodies against a wide range of AdVs in lizards and snakes. Ziele dieser Arbeit waren, Reptilien auf Adenoviren (AdVn) zu untersuchen, serologische Tests für den Nachweis von Antikörpern gegen AdVn in Squamaten zu entwickeln, sowie die serologischen Beziehungen zwischen AdVn bei Echsen und Schlangen zu bestimmen. Diese Untersuchungen sollen zum Aufbau und Erhalt von gesunden Beständen beitragen. Weitere Ziele dieser Arbeit waren die Entwicklung einer Agamid-Zelllinie sowie die Isolierung von AdVn von Bartagamen (Pogona vitticeps).Die Proben wurden mit einer bereits etablierten PCR, die einen Teil des Gens der DNA-abhängigen DNA-Polymerase nachweist, untersucht. Mithilfe dieser PCR wurden in 10,6% der untersuchten Echsen, 6,2% der Schlangen und 4,2% der Schildkröten AdVn entdeckt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zehn neue AdVn entdeckt. Viren, deren Genom im untersuchten Abschnitt weniger als 80% Übereinstimmung mit vorher bekannten AdVn aufwiesen, wurden bei Chinesischen Bartagamen (Japalura splendida), einem Rotkehlanolis (Anolis carolinensis), einem Dreihorn-Chamäleon (Chameleo jacksonii), einer Siedleragame (Agama agama) und einer Griechischen Landschildkröte (Testudo hermanni) nachgewiesen. Ein AdV, welches in einem Bindenwaran (Varanus salvator) nachgewiesen wurde, wies bei der Sequenzierung weniger als 90% Übereinstimmung mit einem vorher bekannten AdV auf. Vier weitere Viren, welche bei der Sequenzierung weniger als 99% Übereinstimmung mit vorher beschriebenen AdVn aufwiesen, wurden in einer Abgottschlange (Boa constrictor), einer Buchstabenschmuckschildkröte (Trachemys scripta), einer Alabama-Höckerschildkröte (Graptemys pulchra) und in einem Blauen Baumwaran (Varanus (Euprepiosaurus) macraei) nachgewiesen. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass alle bei Squamaten nachgewiesenen AdVn, außer den Waran-AdVn, in das Genus Atadenovirus clustern. Alle bisher bekannten Waran-AdVn clustern außerhalb der bisher anerkannten Genera. Alle entdeckten Schildkröten-AdVn clustern in dem vorgeschlagenen Genus Testadenovirus . Für die Isolierung der Bartagamen-AdVn wurde eine Zelllinie aus sechs bis acht Wochen alten Bartagamenembryos entwickelt (Bearded Dragon Embryo Zellen; BDE-Zellen). Diese Zelllinie wurde mit Proben von Bartagamen inokuliert, welche in der PCR vorab AdV-positiv getestet worden waren. Im Rahmen dieser Arbeit konnten elf AdV-Isolate auf BDE-Zellen gezüchtet werden. Die auf den BDE-Zellen isolierten AdVn wurden durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung eines Teiles des DNA-abhängigen DNA-Polymerase Gens identifiziert und zeigten eine 99 bis 100%-ige Nukleotid-Übereinstimmung zum entsprechenden Teil des Agamid AdV-1 (DQ077706). Zwei Isolate wurden außerdem durch eine elektronenmikroskopische Untersuchung des Zellkulturüberstandes als AdVn identifiziert.In Kaninchen wurden polyklonale Antikörper gegen Helodermatid AdV-1 und -2 hergestellt und kamen zusammen mit den im Rahmen dieser Arbeit isolierten AdVn bei der Entwicklung von Neutralisationstests zum Einsatz. Helodermatid AdV-1 und -2, Snake AdV-1 und -2 sowie Agamid AdV-1, welche auf den BDE Zellen isoliert worden waren, wurden eingesetzt, um neutralisierende Antikörper im Plasma von insgesamt 404 Reptilien nachzuweisen. Bei den Echsen und Schlangen wurden hauptsächlich Antikörper gegen Agamid AdV-1 nachgewiesen. Die Mehrheit der untersuchten Krustenechsen wies Antikörper gegen Helodermatid AdV-2 auf. Bei einigen Echsen konnten sowohl Antikörper gegen Helodermatid AdV-1 als auch gegen Agamid AdV-1 nachgewiesen werden. Antikörper gegen Agamid AdV-1 wurden hauptsächlich bei Agamiden nachgewiesen. Eine Krustenechse und zwei Agamen wiesen Antikörper gegen Snake AdV-1 auf. Schlangen wiesen auch Antikörper gegen Helodermatid AdV-2 auf. Antikörper gegen Helodermatid AdV-1 konnten bei keiner der untersuchten Schlangen festgestellt werden. Bei den Vipern wiesen mehr als die Hälfte Antikörper gegen Agamid AdV-1 auf, während Antikörper gegen andere Viren weniger prävalent waren. Die bei Pythons am häufigsten nachgewiesenen Antikörper waren gegen Agamid AdV-1.Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen belegen, dass Infektionen mit AdVn sowohl bei Wildfängen als auch bei in Gefangenschaft gezüchteten Echsen und Schlangen häufig nachweisbar sind. Das Muster der Reaktivität gegen diese Bandbreite an Atadenoviren von Squamaten zeigt, dass diese Viren nicht so artspezifisch sind wie vorher angenommen. Es ist daher möglich, dass diese Viren in der Lage sind, sich zwischen verschiedenen Spezies von Squamaten zu verbreiten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass AdV-Infektionen bei Reptilien häufig vorkommen. Sie vertiefen außerdem unser Verständnis für die genetische Vielfalt dieser Viren. Die Resultate bestätigen weiterhin den Nutzen einer pan-AdV -PCR für den Nachweis von AdVn bei Reptilien wie Squamaten und Schildkröten. Darüber hinaus ist dies der erste Bericht über den Nachweis von Antikörpern gegen eine große Vielfalt von AdVn bei Echsen und Schlangen.