Phäno- und Genotypisierung von Escherichia coli O157-Stämmen aus unterschiedlichen Habitaten

Abstract

Enterohämorrhagische E. coli, vertreten durch die Serogruppe O157, stellen als Erreger hämorrhagischer Diarrhöen und des Hämolytisch-urämischen Syndroms eine erst seit 1982 bekannte Gruppe darmpathogener E. coli dar. Neben weiteren charakteristischen Virulenzfaktoren besitzen sie die Fähigkeit zur Bildung von Verotoxinen.Im Rahmen dieser Arbeit wurden 174 E. coli O157-Stämme der Sammlung des Institutes für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde (Justus-Liebig-Universität Giessen) mittels biochemischer und genotypischer Methoden wie Polymerasekettenreaktion für die Verotoxintypisierung und Pulsfeldgelelektrophorese (mit XbaI und SfiI) untersucht. 144 E. coli O157-Stämme wurden zusätzlich mittels Southern-Blot Hybridisierung mit p-Gen Sonde untersucht. Weiterhin wurden die ß-D-Glucuronidase-Reaktion sowie die Sorbitverwertung als phänotypische Parameter berücksichtigt.Die Stämme wurden aus Stuhl (n = 82), Lebensmitteln (n = 41), Rinderkot (n = 42), Pferdekot (n = 6), Kälberkot (n = 2) und Hundekot (n = 1) isoliert und stammten aus verschiedenen Instituten und Regionen. Der Referenzstamm E. coli NCTC 12900 wurde ebenfalls einbezogen.141 der 174 getesteten E. coli O157-Isolate erwiesen sich nach 18stündiger Bebrütung auf dem Hämorrhagische Colitis-Medium als Sorbit-negativ. 128 dieser Stämme wiesen ferner keine ß-D-Glucuronidase-Aktivität auf. Von den 33 Sorbit-positiven Stämmen konnte bei 32 Stämmen eine ß-D-Glucuronidase-Aktivität nachgewiesen werden.Bei der Verotoxintypisierung der 174 untersuchten Stämme erwiesen sich ein Stamm (0,6 %) als vtx1-positiv, 36 Stämme (20,7 %) als vtx2-positiv, 29 (16,7 %) als vtx2c-positiv, 24 (13,8 %) als gleichzeitig vtx2- und vtx2c-positiv, drei (1,7 %) gleichzeitig vtx1-, vtx2- und vtx2c-positv, neun (5,2 %) als gleichzeitig vtx1- und vtx2c-positiv, 32 (18,4 %) als gleichzeitig vtx1- und vtx2-positiv sowie 40 Stämme (22,9 %) als vtx-negativ.Zwischen allen 175 (einschließlich Stamm NCTC 12900) untersuchten E. coli O157-Stämmen konnte mittels PFGE bei Verdau mit XbaI eine Verwandtschaft von 53,4 6,4 % gefunden werden (Dice-Koeffizient mit 1,2%iger Toleranz). Insgesamt wurden 85 XbaI-Restriktionsfragmentmuster (RFM) gefunden. Die Analyse des SfiI Makrorestriktionsmuster in der PFGE erwies sich als weniger gut geeignet zur Differenzierung von E. coli O157-Stämmen.Innerhalb der 145 (einschließlich Stamm NCTC 12900) mittels p-Gen Analyse untersuchten E. coli O157-Isolate wurden 18 verschiedene p Gen-Profile erkannt.Mit den eigenen Ergebnissen der PFGE-Analyse konnte gezeigt werden, dass identische Klone (identische oder ähnliche XbaI-RFM) von E. coli O157 in verschiedenen Ländern (Dänemark, Kanada, Schottland, den USA und verschiedenen Regionen von Deutschland) gefunden werden können. Gleichfalls konnten fünf XbaI-RFM bei Stämmen aus unterschiedlichen Habitaten (Stuhl, Lebensmittel und Kot) gefunden werden.Mit der PFGE gelang es, die einbezogenen E. coli O157-Stämme in distinkte Klone zu unterteilen. Die erste Gruppe umfasste verotoxinogene, Sorbit- und ß-D-Glucuronidase-negative E. coli O157-Stämme (n = 129; Stämme von XbaI-RFM der Gruppe A und verotoxinogene-Stämme von Tieren einer Mutterkuhherde mit XbaI-RFM B4, B5 und B6). Eine zweite Gruppe setzte sich aus verotoxinogenen, Sorbit-positiven oder -negativen und ß-D-Glucuronidase-positiven E. coli O157-Stämmen (n = 6, XbaI-RFM B1 und B3) zusammen. Die letzte Gruppe bildeten nicht verotoxinogene, ß-D-Glucuronidase-positive und Sorbit-positive oder -negative E. coli O157-Stämme mit niedrigem Verwandtschaftgrad (n = 39).Die PFGE ist laut Literatur eine gute Methode zur Feintypisierung und wurde bereits häufig für diesen Zweck eingesetzt. In der eigenen Arbeit zeigte sich, dass die p Gen-Analyse dazu geeignet ist, zwischen Isolaten zu differenzieren, die einen sehr hohen oder identischen Dice-Koeffizienten aufweisen und ein ähnliches oder identisches Virulenzprofil zeigen.Die PFGE stellt mit Ergänzung von Serotypisierung, biochemischer Analyse, Verotoxintypisierung und p-Gen-Analyse ein wertvolles epidemiologisches Werkzeug zur Typisierung von E. coli O157-Stämmen dar.