Untersuchungen zum Vorkommen von Mykoplasmen und Herpesviren bei freilebenden und in Gefangenschaft gehaltenen Mediterranen Landschildkröten (Testudo hermanni, Testudo graeca graeca und Testudo graeca ibera) in Frankreich und Marokko

Abstract

Ziel der vorgelegten Arbeit war es, das Vorkommen von Mykoplasmen und Herpesviren bei mediterranen Landschildkröten zu bestimmen. Hierzu wurden in den Jahren 1996 und 1997 insgesamt 329 freilebende und in Gefangenschaft gehaltene Maurische und Griechische Landschildkröten untersucht. Bei den 133 freilebenden Schildkröten handelte es sich um 93 Tiere der Subspezies Testudo hermanni hermanni (THH) in Frankreich und 40 Vertreter von Testudo graeca graeca (TGG) in Marokko. Die 196 in Gefangenschaft gehaltenen Schildkröten verteilten sich auf THH (n = 99), TGG (n = 66) und Testudo graeca ibera (TGI; n = 31). Von jedem Tier wurden eine Nasenspül-, eine Zungen- und eine Kloakaltupferprobe sowie eine Blutprobe entnommen. Die Nasenspülproben wurden mittels Anzuchtverfahren sowie einer genusspezifischen Polymerasekettenreaktion (16S-rRNA-PCR) auf Mykoplasmen untersucht. Zum Nachweis von Herpesviren wurde Material der Zungen- und Kloakaltupferproben auf Reptilienzellen (TH1-Zellen) kultiviert und mittels Elektronenmikroskopie näher untersucht. Die Blutproben wurden mit einem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) auf Antikörper gegen Mycoplasma agassizii und in einem Neutralisationstest (NT) unter Verwendung von drei verschiedenen Virusisolaten auf Herpesvirus-neutralisierende Antikörper geprüft. Bei fast allen Untersuchungen bestanden zwischen freilebenden und in Gefangenschaft gehaltenen Schildkröten sowie zwischen den Spezies/Subspezies erhebliche Unterschiede. So ergab die klinische Untersuchung bei 36 (10,9 %) Tieren Anzeichen einer Rhinitis und/oder Stomatitis. Von Krankheitssymptomen war insbesondere ein hoher Anteil (39,4 %) der in Gefangenschaft gehaltenen TGG betroffen. Aber auch gefangene TGI zeigten Symptome (9,7 %). Die Untersuchung der Nasenspülproben mittels Anzuchtverfahren und PCR ergab übereinstimmend, daß 8 (2,4 % aller Tiere) in Gefangenschaft gehaltene Maurische Landschildkröten (TGG und TGI) mit Mykoplasmen infiziert waren. Mit einer Restriktionsenzymanalyse der Amplifikationsprodukte aus dem 16S-rRNA-Gen wurden diese Mycoplasma-Isolate der Spezies Mycoplasma agassizii zugeordnet. Dabei waren fünf der Isolate in ihren Bandenmustern von dem Mycoplasma-agassizii-Referenzstamm PS6 nicht zu unterscheiden. Bei drei Isolaten war eine zusätzliche Sau96 I-Schnittstelle vorhanden, die auf einer bisher unbekannten Punktmutation an Position 802 beruhte (Deletion von Adenosin bei den drei abweichenden Isolaten). Bei 102 (31 %) Schildkröten waren Antikörper gegen Mycoplasma agassizii nachweisbar, wobei 29 der freilebenden (21,8 %) und 73 der in Gefangenschaft gehaltenen Tiere (37,2 %) positiv reagierten. Und auch der Titermittelwert der freilebenden Schildkröten war signifikant niedriger als derjenige von Tieren in Gefangenschaft (p < 0,0005). In beiden Gruppen war TGG (45 % der freilebenden TGG, 63,6 % der in Gefangenschaft gehaltenen TGG) häufiger betroffen als THH (11,8 % der freilebenden THH, 10,1 % der in Gefangenschaft gehaltenen THH). Bei den Tieren in Gefangenschaft reagierten TGI (67,7 %) prozentual am häufigsten serologisch positiv. Ein Herpesvirus-verdächtiges, zytopathogenes Virus konnte nur von einer einzigen Schildkröte, einer weiblichen TGI mit Stomatitis und Rhinitis, isoliert werden, wobei das Virus sowohl aus dem Zungentupfer als auch aus dem Kloakaltupfer anzuzüchten war. Im Herpesvirus-Neutralisationstest reagierten 39 (11,9 %) Tiere positiv mit mindestens zwei der eingesetzten Virusisolate. Hierbei konnten neutralisierende Antikörper aber ausschließlich bei in Gefangenschaft gehaltenen TGG und TGI nachgewiesen werden. THH oder freilebende TGG reagierten im Herpesvirus-NT stets negativ. In Gefangenschaft gehaltene TGI kamen besonders häufig zu positiven Herpesvirus-NT-Ergebnissen, wenngleich die Titer bei TGG und TGI etwa die gleichen Maxima erreichten. Die Korrelationsanalyse der Daten ergab vielfach signifikante Zusammenhänge zwischen den untersuchten Parametern. So waren Erkrankungen des oberen Respirations- und Verdauungstraktes positiv mit dem Nachweis von Mykoplasmen korreliert (p < 0,001). Ein positiver Zusammenhang ließ sich statistisch auch zwischen den genannten Krankheitssymptomen und dem Vorhandensein von Antikörpern gegen Mykoplasmen (p < 0,0005) und gegen Herpesviren (p = 0,041) sichern. Zwischen den Befunden im Mycoplasma-ELISA und bei der kulturell-bakteriologischen Untersuchung auf Mykoplasmen bestand genauso ein hoch signifikanter Zusammenhang (p < 0,0005) wie zwischen den Befunden der PCR-Untersuchung auf Mykoplasmen und den Befunden im Herpesvirus-NT (p = 0,001). Ferner waren die Ergebnisse im Mycoplasma-ELISA mit den Ergebnissen des Herpesvirus-NT positiv korreliert (p < 0,0005). Die ermittelten Speziesunterschiede in der Häufigkeitsverteilung der klinischen Symptome, der Untersuchungsergebnisse auf Mykoplasmen und Herpesviren (TG>TH) legen den Schluß nahe, daß ein enger Kontakt von Testudo graeca und Testudo hermanni möglichst vermieden werden sollte. Da eine klinisch inapparente Infektion mit Erregerausscheidung bei serologisch positiven Schildkröten nicht ausgeschlossen werden kann, sollten solche Tiere haltungstechnisch stets wie infizierte Tiere behandelt und strikt abgesondert werden. Neuzugänge in einen Bestand sollten zunächst grundsätzlich als infiziert betrachtet werden. Entsprechende Vorsichtsmaßnahmen wie Quarantäne, klinische Überwachung sowie wiederholte serologische und bakteriologische/virologische Untersuchungen dieser Schildkröten sind dringend anzuraten. In menschlicher Obhut gehaltene und wieder ausgewilderte Schildkröten stellen als potentielle Träger von Pathogenen wie Herpesviren und Mykoplasmen eine Gefährdung der wenigen verbliebenen freilebenden Landschildkrötenbestände dar. The aim of this study was to determine the incidence of mycoplasma and herpesviruses in Mediterranean tortoises. In 1996 and 1997, a total of 329 terrestrial tortoises were examined. During this study, 133 free-ranging animals, of which 93 were Hermann´s tortoises, (Testudo hermanni hermanni =THH) in France and 40 were Mediterranean spur-thighed tortoises (Testudo graeca graeca= TGG) in Morocco, were evaluated. The 196 animals in captivity were THH (n=99), TGG (n=66) and Testudo graeca ibera (TGI; n=31). A nasal, pharyngeal and cloacal swab as well as a blood sample were taken from each animal. Nasal samples were evaluated for mycoplasma using culture and a genus-specific polymerase chain reaction (16S-rRNA-PCR). Pharyngeal and cloacal swabs were cultured on reptile cells (TH1-cells) and examined more closely with an electron microscope for the detection of herpesvirus. Blood plasma samples were tested for antibodies against Mycoplasma agassizii with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and for neutralising antibodies against herpesvirus by neutralization test with three different isolates. Striking differences in the results regarding species and status (free-ranging or captive) of the tortoises were found in almost all tests. 36 animals (10,9 %) showed clinical signs of stomatitis and/or rhinitis. Of the tortoises in captivity, TGG (39,4 %) and TGI (9,7 %) appeared most prone to showing clinical signs. Using culture and PCR, 8 nasal samples (2,4 %) were positive for the presence of mycoplasma. All of these positive animals were Testudo graeca. By means of restriction enzyme analysis of the amplification products from the 16S-rRNA-gene, these Mycoplasma-isolates were identified as Mycoplasma agassizii. In 5 isolates the band pattern could not be distinguished from the Mycoplasma agassizii reference strain PS6. Three isolates showed an additional Sau96 I-digestion site, which is due to a thus far unknown point mutation in position 802 (deletion of adenosin in the three differing isolates). 102 (31 %) of the tested tortoises were positive for antibodies against Mycoplasma agassizii. 29 free-ranging (21,8 %) and 73 captive animals tested positive. Results indicated that more Testudo graeca were positive than Testudo hermanni. Within the group of animals in captivity, TGI were the animals with the highest percentage of positive results. Free-living tortoises had significantly lower average mycoplasma-ELISA-values than animals in captivity (p < 0,0005). TGG achieved higher levels than THH in both the free-living and captive groups. TGI reached levels that were almost as high as TGG. A cytopathogenic virus was isolated from the pharyngeal and cloacal swab of only one tortoise, a female TGI, with a stomatitis and rhinitis. The virus could be cultured from the pharyngeal as well as the cloacal swab. Using a neutralization test (NT), 39 animals (11,9 %) tested positive for antibodies against at least two of the herpesvirus isolates tested. Only captive TGG and TGI, but no captive THH or free-ranging tortoises were positive in the herpesvirus-NT. TGI in captivity tested positive more often than TGG, but both subspecies had comparable titers. Statistical analysis of the results often showed significant correlation between the analysed parameters. Diseases of the upper respiratory and the digestive tract were positively correlated with isolation of mycoplasma (p < 0,001). A positive correlation was also proven for the presence of the above mentioned symptoms and antibodies against mycoplasma (p < 0,0005) and herpesvirus (p= 0,041). Results of the mycoplasma ELISA and culture for mycoplasma showed highly significant correlation (p< 0,0005) as did mycoplasma-PCR and herpesvirus-NT (p = 0,001). Furthermore, a significant correlation between the presence of antibodies against mycoplasma and herpesvirus was noted during this study (p < 0,0005). The differences among species found regarding incidence of clinical symptoms, and the results of the tests for mycoplasma and herpesvirus (TG>TH) lead to the conclusion that close contact between Testudo graeca and Testudo hermanni should be avoided. As all serologic positive tortoises must be considered latent carriers and are a potential threat for other tortoises, all new introductions in tortoise collections should be treated as possible latent carriers. Thus, preventive measures such as sufficient quarantine, thorough clinical examination and repeated testing for herpesvirus and mycoplasma should be carried out on all new animals. Tortoises that have lived in captivity and are released into the wild are potential carriers of pathogens such as herpesvirus and mycoplasma. They may spread these pathogens and are of high potential risk especially for naive tortoises in free-ranging populations.