Immunmonitoring bei der Therapie der Multiplen Sklerose mit ß-Interferonen : durchflusszytometrische Bestimmungen von Zytokinen und Zytokinrezeptoren

Abstract

1.Die Methode der Durchflusszytometrie wurde für den intrazellulären Nachweis der Zytokine IFNgamma, IL4, IL10 und ebenfalls für den Nachweis der membranständigen Zytokinrezeptoren IFNRII und IL4R in Leukozyten-populationen des peripheren Blutes neu etabliert. 2.Durch Stimulationsassays wurden die optimalen Stimulationsbedingungen ermittelt. Die beste Stimulation wurde bei einer vierstündigen Inkubation mit 10 ng/ml PMA, 500 ng/ml Ionomycin und 25 µM Monensin erreicht. Als geeignetstes Antikoagulans erwies sich Heparin und bezüglich der Lagerungsdauer der Blutproben wurden maximal drei Stunden festgelegt. 3.Die Reproduzierbarkeit der neu etablierten Methoden wurde anhand der Intra-Sample, Intra-Assay- und Inter-Assay-Präzision sowie mit Hilfe von Positivkontrollzellen nachgewiesen. Die gesunden Probanden und die MS-Patienten unterschieden sich in ihrem Zytokin(Rezeptoren)profil. Bei den MS-Patienten wurden hoch signifikant mehr IL10-positive CD3+Zellen und IL10-positive CD3+CD4+Zellen festgestellt. RRMS-Patienten besaßen zudem deutlich mehr IFN& -gamma-positive CD3+CD4+Zellen als Gesunde. 5.Innerhalb des MS-Patientenkollektivs wurden die immunologischen Parameter unabhängig von der Krankheitsdauer, der Anzahl der Schübe und der EDSS-Score exprimiert. Der Progressionsindex korrelierte, insbesondere bei SPMS-Patienten, negativ mit der Th2-Zytokinexpression. 6.Unter IFN-beta-Therapie traten bei MS-Patienten transiente Veränderungen im Zytokin(Rezeptoren)profil auf. Diese waren bei den verschiedenen Präparaten unterschiedlich. 1.A flow cytometric method was established for intracellular staining of the cytokines IFN-gamma, IL-4, IL-10 and for staining of membrane-bound cytokine-receptors IFN-R-II and IL-4R in peripheral blood leukocyte populations. 2.Stimulation conditions were optimized: A four hour incubation with 10ng/ml PMA, 500ng/ml ionomycin and 25µM monensin yielded best stimulation results. Heparin proved to be the most suitable anticoagulants. Blood samples were stored up to 3 hours before use. 3.Intra-sample-, intra-assay- and inter-assay-precision as well as positive controls proved the established methods to be duly reproducible. 4.Patients suffering from multiple sclerosis and healthy control patients differed in their cytokine- and cytokine-receptor profiles. In multiple sclerosis patients we found significantly more IL-10-positive CD3+cells and IL-10-positive CD3+CD4+cells. Furthermore, RRMS patients were shown to have substantially more IFN-gamma-positive CD3+CD4+cells in comparison to healthy controls. 5.The expression of the immunologic parameters within the multiple sclerosis patients group was independent from duration of disease, number of relapses, and EDSS-score respectively. The progression-index was negatively correlated with the Th2-cytokine expression, especially in SPMS patients. 6.Under therapy with IFN-beta; transient changes in the multiple sclerosis patients cytokine- and cytokine-receptor-profiles were shown. These changes differed dependent on the different IFNbeta-preparations.