Untersuchungen zur Prozessierung des Nichtstrukturproteins 2-3 (NS2-3) von Pestiviren

Abstract

Nichtzytopathogene (noncp) Stämme des Pestivirus BVDV (Virus der bovinen Virusdiarrhoe) können nach diaplazentarer Übertragung persistierende Infektionen hervorrufen, die mit einer spezifischen Immuntoleranz gegen das infizierende Virus einhergehen. Infolge von RNA-Rekombinationen oder Mutationen, häufig im Bereich des Nichtstrukturproteins 2 (NS2), entstehen in diesen persistent infizierten Tieren zytopathogene (cp) Viren, die zur tödlichen Krankheit Mucosal Disease (MD) führen. Diese cp BVD-Viren unterscheiden sich von ihren noncp-Vorgängern in zwei Eigenschaften: (i) Sie bilden in infizierten Zellen große Mengen des Nichtstrukturproteins 3 (NS3), während in noncp BVDV-infizierten Zellen bisher nur der ungespaltene Vorläufer NS2-3 gefunden werden konnte; (ii) sie führen zu einer verstärkten intrazellulären Anhäufung viraler RNA. Welches Enzym die NS2-3-Spaltung katalysiert war bislang unbekannt.In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass BVDV NS2 die Funktion einer Cystein-Autoprotease besitzt, die eine entfernte Verwandtschaft zur NS2-3 Autoprotease der Hepaciviren (Hepatitis-C-Virus, HCV) aufweist und für die Prozessierung von NS2-3 verantwortlich ist. Die Funktion der NS2-Protease erwies sich als essentiell für die RNA-Replikation von cp und auch noncp BVDV. Freies NS3, das von dieser Protease generiert wird, spielt daher offenbar eine essentielle Rolle bei der pestiviralen RNA-Replikation und kann in dieser Funktion nicht durch sein Vorläufer-Protein NS2-3 ersetzt werden. Diese Beobachtung führte zur erneuten Suche nach NS3 in noncp BVDV-infizierten Zellen. Tatsächlich konnte, entgegen allen bisherigen Untersuchungen, freies NS3 auch in diesen Zellen nachgewiesen werden. Die Expression des Proteins erfolgt in noncp BVDV-infizierten Zellen allerdings zeitlich reguliert: Im Gegensatz zu cp BVDV-infizierten Zellen konnte NS3 hier nur zu sehr frühen Zeitpunkten nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Syntheserate der viralen RNA korrelierte mit den verschiedenen NS3-Mengen in noncp und cp BVDV-infizierten Zellen. Die unterschiedliche Aktivität der NS2-Protease kontrolliert über die Effizienz der NS3-Generierung also indirekt die RNA-Replikation und beeinflusst damit alle Parameter, die noncp und cp BVD-Viren voneinander unterscheiden: Eine stark herunterregulierte Aktivität der Protease mit geringen NS3-Syntheseraten korreliert mit dem noncp Biotyp und der Fähigkeit des Virus, persistente Infektionen auszulösen; eine hohe Aktivität mit großen NS3 Mengen hingegen korreliert mit dem cp Biotyp und dem Auftreten der tödlichen Krankheit MD. Ein zelluläres Protein aus der Klasse der J-Domänen-Chaperone (Jiv) ist in der Lage, die Prozessierung von NS2-3 zu stimulieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der Mechanismus dieses Vorgangs aufgeklärt werden. Den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zufolge bindet ein 20 Aminosäuren langes Peptid des Jiv-Proteins stabil an zwei verschiedene Stellen im pestiviralen NS2. Zur Induktion der NS2-3-Spaltung werden hingegen 75 Aminosäuren von Jiv benötigt. Dabei ist die Identität von nur einer dieser Aminosäuren für die Stimulierung der Protease essentiell. Es ist daher davon auszugehen, dass Jiv keine eigene proteolytische Funktion besitzt, sondern als Kofaktor der NS2-Protease fungiert. Die Interaktion von Jiv mit den beiden Bindungsstellen im NS2 führt vermutlich zu einer Umfaltung und damit zur Aktivierung der NS2-Protease. Aktuelle und zukünftige Untersuchungen haben zum Ziel, den Mechanismus der zeitlichen Regulierung der NS2-Proteaseaktivität in noncp BVDV-infizierten Zellen aufzuklären. Das Jiv-Protein ist hierzu der bisher aussichtsreichste Kandidat, da Jiv einerseits Kofaktor der NS2-Protease ist, in Wirtszellen aber nur in stark begrenzten Mengen vorkommt. Noncytopathogenic (noncp) strains of the pestivirus bovine viral diarrhea virus (BVDV) can establish persistent infections. In persistently infected animals, mutations in viral non-structural protein 2 (NS2) can result in cytopathogenic (cp) BVDV variants which lead to onset of lethal disease. A hallmark of cp BVDV is high-level expression of the NS3-Protease/helicase which is, together with NS2, derived from NS2-3. In this work evidence for NS2-3 autoprocessing by a cysteine protease in NS2 is presented. This NS2-Protease is distantly related to the NS2-3 autoprotease of hepatitis C viruses and GB viruses. The vital role of the autoprotease, also for noncp BVDV, suggested an essential function of free NS3 in pestiviral RNA replication. Accordingly, contrary to a paradigm, cleavage of NS2-3 was detected in noncp BVDV infected cells. At 6-9 h post infection NS2-3 autoprocessing diminished from almost complete to barely detectable for noncp BVDV but decreased only moderately for cp BVDV. Viral RNA synthesis rates strictly correlated with different NS3 levels in noncp and cp BVDV-infected cells, implicating the NS2 autoprotease in RNA replication control. The phenotype specific regulation indicates a crucial role of the autoprotease in pathogenicity of BVDV. A cellular J-domain-protein (Jiv) was previously shown to interact with NS2 und to stimulate NS2-3 cleavage (Rinck et al., 2001); the second part of this work deals with investigations on the molecular details of this phenomenon. According to the obtained results, a 20 amino acids (aa) Jiv-derived peptide interacts with two distinct binding sites within NS2. The identity of only one amino acid residue of this Jiv is essential for cleavage induction. Accordingly, Jiv does not represent an enzyme but rather a cofactor of the NS2-Protease, which induces an allosteric activation of the enzyme.