Entwicklung eines immunchemischen Nachweisverfahrens für Cefquinom

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung eines enzymimmunologischenVerfahrens zum Nachweis des Cephalosporinantibiotikums Cefquinom in Milch. Hierzu wurden erstmals spezifische Antikörper gegen Cefquinom hergestellt. Zur Herstellung eines immunogenen Cefquinom-Protein-Konjugats wurde Cefquinom mittels Glutardialdehyd an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt (Cefquinom-GAKLH). Mit diesem Konjugat wurden 4 Kaninchen immunisiert. Die gewonnenen Antiserenwurden jeweils im Hinblick auf spezifische Antikörpertiter überprüft und diejenigenAntiseren mit den besten Testeigenschaften einer weiteren Charakterisierung unterzogen. Zur Entwicklung eines kompetitiven direkten Enzymimmuntests wurde Cefquinom unterVerwendung verschiedener Kopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an das EnzymMeerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Unter Verwendung von Anti-Cefquinom-Antiserum eines Tieres (K17) sowie eines mittels p-Benzoquinon-Kopplung hergestelltenKonjugates (Cefquinom-BQ-HRP) konnte ein Testsystem erarbeitet werden, das denNachweis von Cefquinom mit einer Nachweisempfindlichkeit im Bereich des MRL fürCefquinom von 20 ng/ml erlaubte. Für die Entwicklung eines kompetitiven indirekten enzymimmunologischenNachweisverfahrens wurde Cefquinom unter Verwendung verschiedenerKopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an Trägerproteine (bovines Serumalbumin,BSA, Glucose Oxidase, GOx) konjugiert. Unter Verwendung eines mittelsGlutardialdehydkopplung hergestellten Cefquinom-GA-BSA-Konjugates oder einesmittels wasserlöslichem Carbodiimid (CD) hergestellten Cefquinom-CD-GOx-Konjugateskonnten unter Verwendung der Antiseren zweier Tiere (K17, K20) Enzymimmuntestsetabliert werden. Die höchste Testsensitivität wies eine Kombination aus Antiserum K17 und Cefquinom-CD-GOx-Konjugat als Beschichtungsantigen auf. Diese Kombination wurde alsStandardverfahren für den Nachweis von Cefquinom etabliert. Hier konntenNachweisgrenzen für Cefquinom-Standardlösungen im Konzentrationsbereich von 1-2ng/ml erreicht werden. Das Testsystem war hochspezifisch und wies keine meßbarenKreuzreaktionen mit 25 getesteten anderen Cephalosporinen bzw. Penicillinen auf. Die Überprüfung der praktischen Anwendbarkeit des Nachweissystems zum Nachweis vonCefquinom anhand künstlich kontaminierter Rohmilch bzw. pasteurisierter Konsummilchzeigte, dass im Konzentrationsbereich des MRL (10, 20 bzw. 40 ng/ml)Wiederfindungsraten von 80-103% erreichbar waren. Hierzu wurden die Cefquinom-Standardlösungen in 5% (Konsummilch) bzw. 10% (Rohmilch)Magermilchpulverlösung/PBS) hergestellt. Der in dieser Arbeit entwickelte Test ermöglicht somit die Identifizierung undQuantifizierung von Cefquinom in Milch, mit vergleichbarer Empfindlichkeit sie wie fürphysikalisch-chemische Referenzverfahren beschrieben wurde. The presented study describes the development of an enzyme immunoassay (EIA) for thedetection of the cephalosporin antibiotic cefquinome in milk samples. For this purpose itwas necessary to develop specific antibodies against cefquinome, which to our knowledgehad not been achieved before. To create an immunogenic complex, we had to bindcefquinome to the protein keyhole limpet hemocyanin which was accomplished usingglutardialdehyde (Cefquinome-GA-KLH). We inoculated 4 rabbits with this immunogenicconjugate. The received sera were tested for specificity and the best sera were furthercharacterized. For the development of a competitive direct EIA, cefquinome was bound to horseradishperoxidase (HRP) using different coupling substances and several methods of synthesis. Atest was developed with the serum of one rabbit (No 17) against cefquinome and ap-benzoquinone bound conjugate of cefquinome and HRP. This test was able to detectcefquinome in the range of the maximum residue limit (MRL) of 20 ng/ml.For the development of a competitive indirect EIA, cefquinome was coupled to anchorproteins like bovine serum albumin (BSA) and glucose oxidase (GOx). This was achievedusing different binding substances and methods. An EIA was developed with the sera oftwo rabbits (No. 17 and 20) and cefquinome-GA-BSA as well as with a conjugate ofcefquinome, carbodiimidazole (CD) and GOx.The test with a combination of the serum of rabbit No. 17 and Cefquinome-CD-GOx hadthe greatest sensitivity. With this combination a standard test for the detection ofcefquinome was established. The lowest detectable amount of cefquinome standard was 1-2 ng/ml. The EIA was highly specific for cefquinome and no cross reactivity was observedagainst 25 different cephalosporins and penicillins.The practical applicability of this EIA for the detection of cefquinome was verified withartificially contaminated raw milk and pasteurized milk. The milk was inoculated with 10,20 and 40 ng/ml cefquinome which lies in the range of the MRL. The recovery rate wasabout 80 to 103%. The cefquinome standard was dissolved in 5% (pasteurized milk) and in10% (raw milk) skimmed milk-powder/PBS.With the EIA that was developed in this study, it is possible to identify and quantifycefquinome in milk with the same sensitivity as physical-chemical reference tests.