Untersuchungen zum Einfluss von thrombozytären Wachstumsfaktoren auf den zellvermittelten Abbau eines nanopartikulären Knochenersatzstoffes auf Hydroxylapatitbasis : eine experimentelle Studie am Miniaturschwein

Abstract

Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Studie am Miniaturschwein war es, den Einfluss von plättchenreichem Plasma (PRP) auf den zellvermittelten Abbau eines nanopartikulären Hydroxylapatits (HA) in der Frühphase der Knochendefektheilung zu untersuchen. Hierzu wurden 26 männliche Miniaturschweine der Rasse Mini-Lewe in drei Versuchsgruppen eingeteilt und jeweils ein standardisierter Knochendefekt in der Intercondylarregion des rechten Femurs angelegt. Die Defekte wurden entweder mit dem Knochenersatzstoff (Gruppe I/PRP-,n = 11) oder dem Knochenersatzstoff kombiniert mit PRP (Gruppe II/PRP+, n = 11) befüllt. In einer Kontrollgruppe (n = 4) blieben die Defekte unbefüllt. Während derImplantationsoperation wurden bei sechs Tieren jeweils 250 ml Vollblut entnommen, aus dem anschließend durch fraktionierte Zentrifugation plättchenreiches Plasma gewonnen wurde. Die enthaltenen Thrombozyten wurden durch den Zusatz von Thrombin und Kalziumglukonat zur Degranulation angeregt, wodurch die enthaltenen Wachstumsfaktoren aus den alpha-Granulafreigesetzt wurden. Zu diesen Wachstumsfaktoren gehören Platelet Derived Growth Factor AB undBB (PDGF AB, BB), Transforming Growth Factor ß 1 (TGF beta1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). Die Konzentration der genannten Wachstumsfaktoren wurde mit Hilfe der ELISA-Technik bestimmt. Sie lagen zwischenFaktor 1,6 für TGF-beta1 und Faktor 24,4 für bFGF. 20 Tage post operationem fand die Explantation der operierten distalen Femura statt.Zur lichtmikroskopischen Untersuchung fanden die Knochen-Implantat-Proben Eingang in unterschiedliche Techniken der Einbettung (Paraffin-, Kunststoffeinbettungen), Präparation(Paraffinschnitte, Kunststoffschnitte und Schliffpräparationen), Färbung (Toluidinblau, Haematoxylin-Eosin, Safranin) und Histochemie (Enzym-, Immunhistochemie). Darüber hinaus wurden transmissionselektronenmikroskopische und computergestützte histomorphometrische Untersuchungen durchgeführt. Wie die Ergebnisse der Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie aufgezeigt haben, erfolgt in den mit Knochenersatzmaterial behandelten Versuchsgruppen, unabhängig von der PRP-Applikation, die HA-Degradation hydrolytisch und Makrophagen-vermittelt. Die Makrophagen-Population wird durch Riesenzellen vom Langhans-Typ repräsentiert. Diese polarisierten Polykaryen adhärieren über ihre apikale Membrandomäne an den Implantatoberflächen. Das subplasmalemmale Zytoplasma ist immunhistochemisch durch Vimentin-Kondensationen gekennzeichnet. Nicht-adhärente, frei im Granulationsgewebe lokalisierte Polykaryen zeigen dagegen ein homogenes Vimentin-Verteilungsmuster im Zytoplasma. Der zelluläre Abbau des HA erfolgt mittels Phagozytose, indem die Polykaryenden "Fremdkörper" mit pseudopodienartigen Zytoplasmaausläufern umschließen und in ihr Zytoplasma inkorporieren. Diese Art der Degradation wird durch den post implantationem stattfindenden Zerfall des Knochenersatzmaterials in zahlreiche kleine Partikel unterstützt. Die hieraus resultierende Vergrößerung der Implantatoberfläche bietet einer Vielzahl von Zellen dieMöglichkeit zur Haftung. Die festgestellten Expressionsmuster des CD44-Membranglykoproteins verweisen auf dessen funktionelle Rolle im Rahmen der Fusion mononukleärer Makrophagen zu multinukleären Riesenzellen. Die darüber hinaus beobachtete Umverteilung von CD44 von der apikalen zur basalen Membrandomäne bei Implantatassoziierten Polykaryen ist als transientes Geschehen im Zuge der Adhäsion zu interpretieren. Der hohe Aktivitätsstatus der adhärenten Polykaryen ist immunhistochemisch durch eine intensive Kathepsin K-Expression gekennzeichnet. Die vergleichende histomorphometrische Auswertung der mit HA aufgefüllten Defekte dokumentiert eine Verdopplung der Anzahl von Polykaryen in der Gruppe"Knochenersatzstoff mit PRP". Ein auf Basis der Messergebnisse durchgeführter Wilcoxon-Rangsummentest verweist auf den hochsignifikanten Einfluss (p < 0,01) des Faktors PRP auf die Ausdehnung Tartrat-resistenter saurer Phosphatase-positiver Areale in den Präparaten.Diese Effekte können sowohl auf den im PRP angereicherten Wachstumsfaktoren als auch auf dem homologen Charakter der PRP-Zubereitung beruhen. Die beobachteten Polykaryen sogenannte "Fremdkörperriesenzellen" sind auch immer Indikatoren einer stattfindenden Entzündungsreaktion. Die histomorphometrisch dargestellte, deutlich verstärkte Fremdkörperreaktion in Gruppe II/PRP+ kann auf die PRP-Applikation zurückgeführt werden. Im weiteren Heilungsverlauf kann dies zu einer Verzögerung derknöchernen Konsolidierung der Defekte führen. Aim of the current experimental study in Minipigs was to examine the effects of homologousplatelet-rich plasma (PRP) on the cell-mediated degradation of a nanoparticulate hydroxyapatite(HA) during the early phase of bone defect healing.Twenty-six male "Lewe" minipigs were divided into three groups. Standardized bone defectswere created in the intercondylar region of the right femur of each pig and were filled with HA(Group I/PRP-, n = 11) or HA + PRP (Group II/PRP+, n = 11). The defects of the controlgroup (n = 4) were left empty. During the implantation procedure blood was drawn from sixminipigs (250 ml each). PRP was isolated from these blood samples after several centrifugationsteps. After the addition of thrombin and calcium gluconate growth factors were released fromthe alpha-granules of the thrombocytes which were enriched within the PRP. Some of these growthfactors are Platelet Derived Growth Factor AB and BB (PDGF AB, BB), Transforming Growth Factorß 1 (TGF beta1), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and basic Fibroblast Growth Factor(bFGF). The level of enrichment of these growth factors was controlled by the ELISAtechnique. Growth factor enrichment within the PRP ranged from 1.6 fold (TGF-beta1) to 24.4fold (bFGF). After 20 days the treated distal femura were explanted.For light microscopical examination different tissue embedding methods (paraffine, plastic,resin), sectioning techniques (paraffine sections, plastic and resin sections, sawing and grindingsections), staining procedures (toluidine blue, hematoxylin eosin, safranin) and histochemicalmethods (enzyme- and immunohistochemistry) were performed. Additionally transmissionelectron microscopy and computer-assisted histomorphometry were used.The results of light microscopy and transmission electron microscopy showed that regardless ofthe addition of PRP, the HA is degraded by hydrolysis and macrophages. The population ofmacrophages consists of Langhans-type giant cells. The adhesion of the polarized polykaryonsat the surfaces of the implant is mediated by the apical domain of the plasmamembranes. Vimentin condensations of the cytoplasm are attached to the apical plasmalemma. In contrast,non-adherent polykaryons of the granulation tissue reveal a homogeneous Vimentindistribution pattern within their cytoplasma. As shown ultrastructurally, the implant is degraded by means of phagocytosis. The implantparticles are encircled by pseudopodia of the polykaryons and become incorporated into thecytoplasma. The degradation process is supported by disintegration of the bone substitute intonumerous small particles after implantation. This disintegration causes enlargement of theimplant surface and increases the probability of phagocyte adhesion.The pattern of CD44 expression points towards a functional role of the molecule during fusionof mononucleated macrophages into multinucleated giant cells. Implant-associated polykaryonsshow CD44 immunoreactivity only along the basal domains of the cytomembrane. This patterncan be interpreted as a temporal event during adhesion. Adherent polykaryons are furthercharacterized by strong cathepsin K expression.The histomorphometric examination demonstrates twice as much foreign body giant cells in"Group II/PRP+" as in "Group I/PRP-". Based on these results, a Wilcoxon-signed-rank testwas performed and a highly significant effect (p < 0.01) of PRP on the expansion of tartrateresistent acid phophatase (TRAP)-positive areas within bone defects could be demonstrated. This effect could be a result of the substution of PRP or of its homologous character. The polykaryons descibed in this work - so-called Foreign Body Giant Cells - are also indicators ofinflammation. The enhanced cellular reaction observed in Group II/PRP+ must be interpretedas a strong foreign body reaction, triggered by the addition of PRP. It cannot be excluded thatthe strong inflammation reaction will lead to delayed bone formation in the course of healing.