Charakterisierung des Core-Proteins von Pestiviren

Abstract

Die subzelluläre Lokalisierung und die RNS bindende Aktivität des Core-Proteins von Pestiviren wurden untersucht und folgende Ergebnisse erzielt: 1.- Das Gen des Core-Proteins von KSPV und BVDV wurde in einen prokaryotischen Expressionsvektor kloniert, das Core-Protein in Bakterien (E. coli) exprimiert und durch Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) in hohem Maß gereinigt. Dieses Protein fand Anwendung als Antigen zur Herstellung von mAks und stellte die Basis eines RNS-Bindungsassays dar. 2.- Ein System zum Screening von Hybridom Überständen wurde entwickelt, mit dem acht anti Core-Protein mAk produzierende Hybridome isoliert wurden. Die Anwendung der hergestellten mAks ermöglichte die Detektion des Core-Proteins von 13 Pestiviren verschiedener Spezies [BVDV-1 (7 Stämme); BVDV-2 (2 Stämme); BDV (2 Stämme); KSPV; Giraffe] in infizierten Zellen und aufkonzentrierten Virionen. 3.- Ein Disulfid verbrücktes Core-Protein Homodimer wurde in Virionen von BVDV-2 Stämmen identifiziert und mittels reverser Genetik charakterisiert. Wie bei den Flaviviren kommt das Core-Protein in Virionen von Pestiviren sehr wahrscheinlich als Dimer vor. 4.- In infizierten Zellen kolokalisierte das Core-Protein mit dem endoplasmatischen Retikulum und mit den Mitochondrien. Auch wurde dieses Protein in Assoziation mit den RNA-processing bodies ( P-Bodies ) nachgewiesen, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der Translation spielen. Eine Kolokalisierung des Core-Proteins mit Komponenten der pestiviralen Replikase, nämlich NS3 und NS5B, wurde festgestellt. Das NS5B (virale RNS-abhängige RNS-Polymerase) wurde, wie die drei Strukturproteine Erns, E1 und E2, überwiegend ER assoziiert nachgewiesen. Aufgrund seiner Verteilung könnte das Core-Protein in der infizierten Zelle Prozesse wie z.B. Translation beeinflussen. Die Lokalisierung der Nichtstruktur- bzw. Strukturproteine deutet darauf hin, dass assembly und Replikation bei Pestiviren in demselben Kompartiment stattfinden. 5.- Ein Agarose RNS-Bindungsassay wurde zur Untersuchung der RNS-Bindungsaktivität des Core-Proteins entwickelt. Das Core-Protein band RNS sequenzunabhängig und somit kann die Inkorporation genomischer RNS in die pestiviralen Virionen aufgrund einer spezifischen RNS bindenden Aktivität des Core-Proteins ausgeschlossen werden. Sehr wahrscheinlich wird es durch das zeitlich koordinierte Erfolgen der Replikation des viralen Genoms und des Virus assembly ermöglicht. The subcellular localization and RNA binding activity of the core-protein from pestiviruses were studied and the following results were obtained: 1.- The gene of the core-protein from CSFV and BVDV was cloned in a prokaryotic expression vector. After expression in bacteria (E. coli) the protein was purified by Immobilized Methal Affinity Chromatography (IMAC), and used as antigen to produce mAbs and also in a RNA-binding assay. 2.- A system for the screening from hybridoma supernatants was developed which allowed the isolation of eight hybridomas that produce an core-protein mAbs. The generated mAbs proved to be useful to detect the core-protein of different Pestivirus species [BVDV-1 (7 strains); BVDV-2 (2 strains); BDV (2 strains); CSFV; giraffe] in infected cells and concentrated virions.3.- A core-protein disulfide bond-linked homodimer was identified in virions from BVDV-2 strains and was characterized by reverse genetics. It is very probable that, like the core-protein from flaviviruses, the pestiviral core-protein is found as a dimer in virions. 4.- In infected cells the core-protein colocalized with the endoplasmic reticulum und mitochondria. This protein was also found in association with RNA-processing bodies ( P-Bodies ), which play an important role in the regulation of translation. The core-protein also colocalized with components of the pestiviral replicase, namely NS3 and NS5B. The NS5B (viral RNA-dependent RNA polymerase), and the three structural proteins Erns, E1 und E2 associated mainly with the endoplasmic reticulum. Due to its distribution in the infected cell the core-protein could influence processes like i.e. translation. The localization patterns of the nonstructural and structural proteins indicate that in the case of pestiviruses assembly and replication could take place in the same compartment. 5.- An agarose RNA-binding assay was developed to study the RNA-binding activity of the core-protein. The core-protein bound RNA in a sequence independent manner, which excludes the possibility that the incorporation of viral genomes in the virions is due to a sequence specific interaction of the core-protein with the pestiviral RNA. Instead the specific incorporation of the viral genome very likely occurs due to the compartimentalized and time coordinated replication of the viral genome and the virus assembly.