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dc.contributor.authorSchönberger, Barbara
dc.date.accessioned2023-03-08T17:40:28Z
dc.date.available2007-08-06T08:58:25Z
dc.date.available2023-03-08T17:40:28Z
dc.date.issued2007
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-48221
dc.identifier.urihttps://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/12807
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.22029/jlupub-12190
dc.description.abstractDas Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt eine RNA mit positiver Orientierung. Das Genom enthält ca. 9600 Nukleotide, die für ein einziges Polyprotein mit einer Länge von ca. 3000 AS kodieren. An beiden Seiten des Genoms befindet sich jeweils eine nicht-translatierte Region (5 NTR, 3 NTR). Das Polyprotein wird co-und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in mindestens 10 Proteine gespalten. Lange Zeit stand kein geeignetes Zellkultursystem mit replizierender HCV-RNA zur Verfügung. Das vor einigen Jahren entwickelte Replikationsmodell mit replizierenden subgenomischen Abschnitten von HCV-RNA des Genotyps 1b ermöglicht neben der Untersuchung des viralen Replikationszyklus und der Proteinexpression die Austestung von antiviralen Substanzen. Nachfolgend wurden Isolate weiterer Genotypen (1a/b, 2a) beschrieben, die in Zellkultur erfolgreich replizieren. Mit Ausnahme des HCV-Genotyps 2a steht für die entwickelten Replikonsysteme keine Information der jeweiligen HCV Isolate bezüglich Resistenz bzw. Sensitivität gegenüber einer IFN basierten Therapie im Patienten zu Verfügung. Ein System mit replizierender subgenomischer HCV-RNA des Genotyps 3a wurde bis dato nicht beschrieben. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Replikonkonstrukten von HCV-Isolaten des Genotyps 3a. Für die Herstellung dieser Replikonkonstrukte wurden Isolate ausgewählt, die unterschiedlich auf die Therapie angesprochen hatten, was im späteren Verlauf vergleichende Untersuchungen bei der Erforschung von Resistenzmechanismen der einzelnen HCV Isolate ermöglichen sollte. Im ersten Schritt erfolgte die Amplifikation des gesamten Genomabschnittes, der für die Nichtstrukturproteine NS3-NS5B kodiert. Nach Analyse der Aminosäuresequenz der Proteine NS3-NS5B von vier Klonen wurden von beiden Isolaten die entsprechenden Konsensusklone generiert, auf deren Basis RNA-Replikonkonstrukte hergestellt wurden. Zusätzlich erfolgte die Generierung von Replikonkonstrukten, die eine Mutation in den einzelnen NS-Genen NS3, NS4B, NS5A enthielten, die bereits bei anderen in Zellkultur replizierenden Isolaten als adaptiv beschrieben worden waren. Zudem wurden Replikonkonstrukte hergestellt, die neben den Nichtstrukturproteinen die 3 NTR eines Genotyp 3a-Isolates enthielten. Es erfolgte die Transfektion von naiven HuH-7 Zellen sowie einer adaptierten Zellinie (HuH-7.5) mit den in dieser Arbeit hergestellten Replikonkonstrukten. Parallel wurden HuH-7 Zellen mit dem bereits etablierten Replikonkonstrukt vom Genotyp 1b transfiziert. Nach Transfektion der Zellen mit den in dieser Arbeit hergestellten Replikonkonstrukten konnten unter G418 keine Zellen selektioniert werden, in denen HCV-RNA des Genotyps 3a erfolgreich replizierte. Zusammenfassend konnte der Versuch ein HCV-Replikonsystem mit replizierenden subgenomischen Abschnitten des Genotyps 3a zu etablieren, nicht erfolgreich abgeschlossen werden.de_DE
dc.description.abstractHepatitis C virus is a positive-strand RNA virus that belongs to the family Flaviviridae. Its genome of about 9.6 kb is composed of the 5 non-translated region (5 NTR), an open reading frame encoding for a large polyprotein of approximately 3000 amino acid residues and the 3 NTR. This polyprotein is co-and post-translationally processed by host and viral proteases into at least 10 distinct products. For a long time, a cell culture model not was available in which HCV RNA replicates efficiently, thus allowing to study HCV replication as well as the evaluation of antiviral drugs. The establishment of a cell culture system based on the transfection of cloned viral consensus genome sequence HCV Con1 genotype 1b replicating in HuH-7 cells opened the possibility to study HCV translation and RNA replication in human hepatoma derived (HuH 7) cells. During the last years replication competent replicons have been constructed including genotypes 1a/b and 2a. With the exception of genotype 2a isolate, the interferon sensitivity of the parenteral virus from which the existing replicons have been generated was unknown. A replicon system with HCV genotype 3a has not been established. Accordingly, the aim of the study was to establish a replicon system with replicating HCV RNA based on HCV 3a isolates from patients that show sustained virologic response and a non sustained response, respectively, to IFN-α/Ribavirin combination therapy. This replicon system should provide a tool for the investigation of mechanisms inducing resistance to IFN-alpha based therapy. Using long-distance RT-PCR, the complete ORF of each isolate containing the NS proteins, NS3-NS5B, was amplified. The sequences of four clones of each isolate were analyzed followed by the generation of constructs based on the viral consensus genome sequence. Replicon constructs were generated containing the wildtype consensus genome and adaptive mutations in NS3, NS4B and NS5A that enhance replication of HCV con 1 in cell culture. Furthermore, replicon constructs were produced containing the 3 NTR from a genotype 3a isolate. Naive HuH-7 cells and an adapted HuH-7 cell line were transfected with in vitro transcripts corresponding to the cloned subgenomic genomes. In parallel a replicon construct containing the HCV con1 was transfected into HuH-7 cells. Cells were selected with G418 and the clones obtained after transfection were analyzed. However no HCV-RNA could be detected for wildtype or adaptive constructs.en
dc.language.isode_DEde_DE
dc.rightsIn Copyright*
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/page/InC/1.0/*
dc.subjectHepatitis-C-Virusde_DE
dc.subjectReplikonsystemde_DE
dc.subjectKonsensussequenzde_DE
dc.subjectGenotyp 3ade_DE
dc.subjectHepatitis C Virusen
dc.subjectreplicon systemen
dc.subjectconsensus sequenceen
dc.subjectgenotype 3aen
dc.subject.ddcddc:630de_DE
dc.titleEntwicklung von Replikonsystemen mit subgenomischen Abschnitten von HCV-RNA Genotyp 3a Isolaten klinisch charakterisierter Patientende_DE
dc.title.alternativeDevelopment of subgenomic hepatitis C virus replicons derived from clinically characterized genotype 3a infected patientsen
dc.typedoctoralThesisde_DE
dcterms.dateAccepted2007-05-10
local.affiliationFB 10 - Veterinärmedizinde_DE
thesis.levelthesis.doctoralde_DE
local.opus.id4822
local.opus.instituteInstitut für Virologie; Klinik für Innere Medizin II, Universitätskliniken des Saarlandes, Homburgde_DE
local.opus.fachgebietVeterinärmedizinde_DE


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