Intrazelluläre Ca2+-Transporter im Kolonepithel der Ratte : Untersuchungen von Ryanodinrezeptoren sowie SERCAs

Abstract

Der Ryanodinrezeptor ist ein wichtiger Regulator der intrazellulären Ca2+-Homöostase. Im Kolonepithel ist dieser Ca2+-Kanal zwar funktionell bereits untersucht worden, es lagen bisher allerdings keine weiteren Daten vor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf molekularbiologischer Ebene mittels PCR nachgewiesen, dass im Kolonepithel der Ratte der Subtyp-1 des RyRs exprimiert wird. Über immunhistochemische Untersuchungen zeigte sich seine gleichmäßige Verteilung entlang der Kryptenachse und seine zytoplasmatische Lokalisation. Da neben dem RyR-Signalweg der IP3-Signalweg als wichtigster Modulator der intrazellulären Ca2+-Freisetzung gilt, wurden immunhistochemische Doppelfärbungen durchgeführt, die ergaben, dass diese beiden Ca2+-Kanäle nicht nennenswert kolokalisiert sind. Die Spezifität des in der Immunhistochemie eingesetzten RyR-Antikörpers wurde mit einem Western Blot bestätigt. Die CD38/ADP-Ribosyl Zyklase, die die Synthese der cADP-Ribose, einem physiologischen Agonisten des RyR, katalysiert, konnte ebenfalls in Immunfluoreszenzfärbungen im Kolonepithel der Ratte nachgewiesen werden. Dieses Enzym zeigt eine zytoplasmatische Lokalisation in den Enterozyten, mit gleichmäßiger Verteilung entlang der Kryptenachse. Neben der intrazellulären Ca2+-Speicherentleerung in diesen Zellen wurde auch der Mechanismus der Wiederbefüllung untersucht. Mittels PCR wurde die Expression der SERCA Subtypen-2b oder -3 im Kolonepithel nachgewiesen. Um eine Differenzierung zwischen diesen beiden Isoformen vornehmen zu können, wurde wiederum die Immunfluoreszenz herangezogen. Sowohl SERCA-2b als auch SERCA-3 haben in diesem Gewebe zytoplasmatische und nukleäre Lokalisationen und zeigen einen leichten Gradienten von der Oberfläche der Krypten bis hin zu deren Fundus, wo sie weniger stark exprimiert werden. Monochloramin, ein Stoff, der die Öffnungswahrscheinlichkeit des RyRs erhöht, zeigte in Fura-2-Experimenten eine intrazelluläre Ca2+-Speicherentleerung, die sich durch Ruthenium Rot blockieren ließ. Arachidonsäure konnte hingegen, unter gleichen Versuchsbedingungen, keine Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern auslösen. Um die beiden wichtigsten intrazellulären Ca2+-Signalwege über RyRs und IP3Rs in direktem funktionellen Zusammenhang zu untersuchen, wurden Mag-Fura-2-Experimente durchgeführt. Sie ergaben, dass RyRs aus anderen Ca2+-Speichern Kalzium freisetzen als die IP3Rs, wobei über IP3Rs mehr Kalzium freigesetzt wurde als über den RyR-1. Im Kolonepithel der Ratte wird demnach neben dem IP3-Rezeptor Subtyp-2 und -3 auch der Ryanodinrezeptor Subtyp-1 exprimiert, der ebenfalls eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Ca2+-Freisetzung in nicht-erregbaren Geweben spielt. The ryanodine receptor (RyR) is an important regulator of the intracellular Ca2+-homoeostasis. This Ca2+-channel has only been functionally described at the colonic epithelium. Therefore, PCR experiments were performed at crypts isolated from rat colon. They demonstrated the expression of subtype-1 of the RyR in this tissue. Immunohistochemical experiments revealed an even distribution of this Ca2+-channel along the crypt axis with a cytoplasmic localisation. As the IP3-signalling pathway, along with the RyR one, is postulated to be responsible for intracellular Ca2+-release from intracellular stores, immunohistochemical doublestaining were performed. These experiments did not reveal a relevant colocalisation of both Ca2+-channels. The specifity of the RyR-antibody used in immunohistochemistry was confirmed by a Western Blot. Immunofluorescent stainings revealed the existence of CD38/ADP-ribosyl cyclase in the colon epithelium of the rat; this enzyme catalyses the synthesis of cADP-ribose, a physiological agonist of RyR. As is the case with RyR-1, this peptide is localized cytoplasmatically in the enterozytes, evenly distributed along the crypt axis. Both the intracellular Ca2+-storage release in these cells and the mechanism of refilling were analysed. By way of PCR, the expression of SERCA subtypes-2b or -3 in the colon epithelium was proven. In order to differentiate between those two isoforms, again immunofluorescence was used. Both SERCA-2b and SERCA-3 have cytoplasmatic and nuclear localisations in this tissue and show a slight gradient from the surface of the crypts in direction of their fundus where they are expressed with a lower intensity. Monochloramine, a substance that increases the opening probability of RyR, caused a release of intracellularly stored Ca2+ at fura-2-loaded cryps, which was blocked by ruthenium red. In contrast, under the same experimental conditions, arachidonic acid did not cause Ca2+-release from intracellular reservoirs. In order to investigate the two most important Ca2+-signalling pathways by way of RyRs and IP3Rs in direct functional comparison, mag-fura-2 experiments were performed. Their results proved both mechanisms to be independent from each other; however, IP3R-mediated release was always stronger than RyR-mediated release. Consequently, at rat colonic epithelium there is an expression of RyR-1 beside IP3R-2 and IP3R-3. These channel types play a dominant role for the release of intracellular calcium in non-excitable cells.