Untersuchungen zur Modulation der prädiabetischen Inselentzündung im Tiermodell der NOD-Maus

Abstract

Der insulinabhängige Diabetes Mellitus (IDDM) oder Typ 1 Diabetes resultiert aus einer immun-mediierten Zerstörung der insulinproduzierenden beta-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas. Die Th1-/Th2-Immunbalance spielt dabei eine wichtige Rolle. T-Helferzellen vom Th1-Typ und deren Zytokinprodukte (z.B. INF-gamma, TNF-alpha) werden als pathogene Immunmechanismen bei der Krankheitsentstehung beschrieben, wohingegen Th-2-assoziierte Immunzellen und deren Zytokinprodukte (z.B. IL-10, TGF-beta) als kaum destruktiv oder sogar als protektiv gelten [2, 3, 25]. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem pathoimmunologischen Krankheitsgeschehen des Cyclophosphamid-induzierten Typ 1 Diabetes im Tiermodell der non obese diabetic (NOD) Maus. Bei der NOD-Maus kommt es durch Infiltration mit mononukleären Zellen zu einer autoimmunen Zerstörung der beta-Zellen im Pankreas. Zu den infiltrierenden Zellen zählen u.a. Lymphocyten, die in Darm-assozierten Immungeweben vorkommen [86, 87]. So konnte gezeigt werden, dass der Verlauf des IDDM über das Darmimmunsystem zu beeinflussen ist. Sowohl Nahrungsmittelantigene, diätetische Fütterung, als auch die orale Verabreichung von spezifischen Wirkstoffen auf das Darmimmunsystem konnten den Krankheitsprozess des Typ 1 Diabetes hemmen [51, 53, 56, 57]. Das Alkylanz Cyclophosphamid beschleunigt und synchronisiert im NOD-Modell schon nach einmaliger Injektion das Krankheitsgeschehen. Es kommt zu einem Übergang von einer Th2- zu einer Th-1-Immunantwort [11]. Das Aussmaß der Infiltration in den Langerhans-Inseln des Pankreas bestimmt den Grad der Inselentzündung. Die vorliegenden histologischen Untersuchungen erlaubten eine Unterteilung der Insulitis in vier Grade. Im Mausversuch kam es 10 Tage nach intraperitonealer Injektion von 250 mg/kg Cyclophosphamid bei weiblichen NOD-Mäusen zu einer massiven Infiltration der Inseln und zu einem signifikanten Anstieg der Insulitis auf durchschnittlich Grad 4 (p<0,0002 Experiment 1; p<0,002 Experiment 2). Cyclophosphamid induzierte innerhalb von 10 Tagen die Entwicklung einer destruktiven Intrainsulitis. Diese Ergebnisse stützen vorherige Versuche, bei denen die Progression des Infiltrationsgeschehens durch die Gabe von Cyclophosphamid gezeigt werden konnte [10, 11, 14]. Ein nächster Forschungsansatz waren Zytokinmessungen von Dünndarm mRNA von NOD-Mäusen. Es wurde der Effekt des Cyclophosphamids auf die intestinale Zytokinexpression 3 bzw. 7 Tage nach Injektion gemessen. 6 bis 7 Wochen alte, weibliche NOD-Mäuse wurden mit 250 mg/kg Cyclophosphamid intraperitoneal behandelt. Der Gehalt an mRNA von TGF-beta, IFN-gamma, IL-10 und TNF-alpha wurde mittels quantitativer RT-PCR aus Dünndarm isolierter RNA bestimmt. Innerhalb von 3 Tagen zeigte sich eine sinkende Expressionsrate von IL-10, welches mit einer Th2-Immunantwort assoziiert wird. Das Ziel der Vakzinierungsstudie war eine Modulation des Immungeschehens über die Darmmukosa. In der Vergangenheit konnten durch DNA-Vakzinierung protektive Immunantworten bei infektiösen und autoimmunen Krankheitsbildern ausgelöst werden [60, 63]. Diese Induktion einer schützenden Th2-Antwort durch eine Immunisierung mit DNA könnte den Verlauf des Typ 1 Diabetes günstig beeinflussen. 70 Tage alte, weibliche NOD-Mäuse wurden mit Plasmid-DNA-Konstrukten, welche kodierend für TGF-beta, hsp60 oder lösliches ICAM-1 waren, oral behandelt. Um den Krankheitsverlauf zu synchronisieren, erhielten die Tiere 250 mg/kg Cyclophosphamid via intraperitonealer Injektion. Ein Teil der Tiere wurde ausschließlich mit Cyclophosphamid behandelt und fungierte als Kontrollgruppen. Semiquantitative histologische Untersuchungen und immunhistologische Insulinfärbungen zeigten, dass die orale Vakzinierung mit pDNA-Konstrukten das Ausmaß der Inselinfiltration, induziert durch Cyclophosphamid, nicht nachhaltig beeinflussen konnte. Quantitative RT-PCR Analysen von RNA aus dem korrespondierenden Pankreasgewebe zeigten jedoch für die Administration mit ICAM-1-Vakzine und TGF-beta-Vakzine steigende mRNA-Spiegel für IL-10. Dies spricht für eine entzündungshemmende regulatorische Immunantwort [4, 84]. The insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) results from an immune-mediated destruction of the insulin-producing beta-cells in the pancreatic islets of Langerhans. The Th1-/Th2-immune balance is an important immunological regulator for the progression of the disease. A current hypothesis is that the pathogenic immune response is mediated by a Th1 subset of T-cells and their cytokine products (e.g. IFN-gamma, TNF-alpha), whereas the protective immune response is mediated by a Th2 subset of T-cells and their cytokine products (e.g. IL-10, TGF-beta) [2, 3, 25]. The present studies are about the patho-immunological process of type 1 diabetes in non obese diabetic (NOD) mice, induced by cyclophosphamide.The NOD-mouse model is an animal model of IDDM that shows autoimmune destruction of the pancreatic beta-cells by infiltration with mononuclear cells. Mucosa-derived lymphocytes are described to be among the early infiltrating cells [86, 87]. Attempts to modulate disease progression by targeting the gut immune system seem to be an option to interfere with the disease process. Both food antigens, diet type and oral administration of specific agents were found to exhibit inhibitory effects on the disease progression [51, 53, 56, 57]. The alkylating drug cyclophosphamide has been used to accelerate and synchronise the disease process by inducing a shift from Th2-type to Th1-type immune reactivity [10, 11, 14]. The mononuclear infiltration of pancreatic islets is an inflammatory process named insulitis. Histological examinations allowed to score the insulitis by 4 degrees. The present results showed that a single intraperitoneal injection of cyclophosphamide (250 mg/kg) in female NOD mice resulted in a rapid increase intra-islet infiltration and insulitis of degree 4 (p<0.0002 experiment 1; p<0.002 experiment 2). Cyclophosphamide induced a destructive intra-insulitis within 10 days. We analysed the effect of cyclophosphamide treatment on the intestinal cytokine pattern of 6 to 7 weeks old female NOD mice. Therefore, the animals were treated with a single injection of 250 mg/kg cyclophosphamide. Control mice remained untreated. The RNA was isolated on day 3 or day 10 from small intestinal tissue and the levels of TGF-beta, IFN-gamma, IL-10 and TNF-alpha mRNA were detected by quantitative RT-PCR analysis. We found decreased IL-10 mRNA expression within 3 days after cyclophosphamide injection. IL-10 is a key cytokine of the Th2-immune response. Our aim was to modulate the immune response via the enteral mucosal immune cells by oral vaccination with plasmid DNA encoding for TGF-beta, hsp60 or soluble ICAM-1, i.e., by targeting the mucosal immune system. DNA vaccination can generate protective immunity against infectious and autoimmune diseases [60, 63]. The induction of protective Th2 responses by DNA immunisation might therefore be expected to have an effect on the course of type 1 diabetes.70 days old female NOD mice were fed with plasmid DNA and received a single injection of 250 mg/kg cyclophosphamide. One group of mice was treated with cyclophosphamide only and served as controls. Histologic sections and immunohistochemical analysis of pancreas sections showed that oral vaccination with DNA encoding immunomodulatory molecules had no inhibitory effect on the destructive islet infiltration process. Quantitative RT-PCR analysis of corresponding pancreas mRNA showed an increase of IL-10 cytokine levels for ICAM-1 and TGF-beta treated groups. This suggests the induction of an anti-inflammatory regulatory immune response [4, 84].