Nachweis von Osteopontin in der extrazellulären Matrix der Rinderplazenta

Abstract

Die Expression von Osteopontin (OPN) wurde an Rinderplazenten vom 30. bis 270. Tag der Trächtigkeit mittels immunhistochemischem Nachweisverfahren und Immun-fluoreszenz unter Verwendung von fluoreszeinmarkierten Esel Anti-Kaninchen Antikörpern ermittelt und lichtmikroskopisch beziehungsweise mit dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Hierfür wurden Gefrierschnitte verwendet. Des Weiteren wurde OPN mRNA mittels der RT-PCR und der In situ Hybridisierung nachgewiesen. Die Extraktion von OPN mRNA und OPN Protein erfolgte aus schockgefrorenen Rinderplazentomen. Immunhistochemisch war plazentomär eine starke, meist gefäßassoziierte Immunreaktion im maternalen Stroma zu finden. Im fetalen Mesenchym zeigten besonders Endothelien eine starke Immunfärbung für Osteopontin, während die umgebenden Fibroblasten nur eine schwache Färbung aufwiesen. Interplazentomär war apikal im Chorionepithel, sowie im Uterus- oder Karunkelepithel eine starke Immunantwort zu sehen. In der Immunfluoreszenz zeigte sich plazentomär eine starke Immunreaktion in den Trophoblastzellen und ein schwächeres Signal im maternalen Stroma. Interplazentomär konnte eine starke Immunfärbung apikal in den Zellen der uterinen Drüsen nachgewiesen werden. In der Immunhistochemie und -fluoreszenz erzeugten die Osteopontin Antikörper LF-123 und LF-124 ein starkes gefäßassoziiertes Signal. Die zugehörige Osteopontin mRNA wurde mittels eines spezifischen 333 bp RT-PCR Produktes in drei verschiedenen Trächtigkeitsstadien (Tag 120, 180 und 270) nachgewiesen. Über in situ Hybridisierung wurde OPN mRNA plazentomär in Gefäßendothelzellen des maternalen Stromas und im fetalen Mesenchym lokalisiert. Interplazentomär erfolgte der Nachweis von OPN Transkripten im fetalen Mesenchym und auch dort vor allem in den Endothelzellen sowie in einer Population von noch näher zu charakterisierenden Zellen, die möglicherweise dem Immunsystem zuzurechnen sind. Die OPN mRNA und -proteinexpression zeigte beim Rind keine signifikanten Unterschiede im Verlauf der Trächtigkeit. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie lässt sich schließen, dass OPN an zwei Orten produziert und sezerniert wird; erstens in den uterinen Drüsen und zweitens in den Zellen des maternalen Septenstromas sowie in den Zellen des fetalen Zottenmesenchyms. Diese Tatsache spricht für mindestens zwei differenzierte Funktionen von OPN. 1. OPN könnte auch beim Rind die feto-maternalen Anheftung während der Implantation vermitteln, die nicht Gegenstand dieser Studie war. Hier verteilt sich in den Drüsen produziertes OPN an der feto-maternalen Grenzfläche und fungiert als Brückenmolekül zwischen Oberflächenrezeptoren (z.B. Integrinen) des Trophoblasten und des uterinen Epithels. 2. OPN spielt vermutlich als ein Ligand für die Integrinrezeptoren im maternalen Stroma und im fetalen Mesenchym eine Rolle und nimmt so möglicherweise Einfluss auf das Wachstum und die Ausdifferenzierung von maternalen Septen und fetalen Zotten. The expression of osteopontin was determined in bovine placentomes between day 30 and day 270 of gestation by using immunohistochemical methods (Avidin-Biotin-Complex) and immunofluorescence staining (fluorescein-conjugated goat antibody against rabbit IgG) and was examined via light microscopy or with fluorescence microscopy. To do so, frozen sections were utilized. Furthermore, the presence of OPN mRNA was detected by means of RT-PCR and localized in tissue sections by in situ hybridisation. The extraction of OPN mRNA and protein was done from shock frozen bovine placentomes. In placentomes, immunohistochemistry showed a strong mostly vasculature-associated immunoreaction in the maternal stroma. In the fetal mesenchyme especially endothelial cells showed a strong immunostaining for OPN, while the surrounding fibroblasts showed only a weak reaction. In interplacentomal areas, a strong immune answer was observed apically in the chorionic epithelium as well as in the uterine or caruncle epithelium. Using immunofluorescence, a strong immunological reaction appeared in placentomal trophoblast cells, while a weaker signal was observed in the maternal stroma. In interplacentomal areas, a strong immunostaining occurred apically in uterine glandular epithelium. With both methods the OPN antibodies LF-123 and LF-124 generated a strong vasculature related signal. The corresponding OPN mRNA was detected as a specific 333 bp RT-PCR product in three different stages of pregnancy (days 120, 180 and 270). In situ hybridisation localized OPN mRNA in the blood vessel walls of the maternal stroma and in the endothelial cells of the fetal mesenchyme in placentomes. In interplacentomal areas, OPN transcripts occurred in the fetal mesenchyme especially in endothelial cells as well as in a population of yet unidentified cells, which may be immune cells. In the course of the pregnancy no significant differences were observed concerning the OPN mRNA- and protein expression between the different stages. From the results of the present study it can be concluded that OPN is produced in two distinct localizations of the bovine placenta, firstly in the uterine glands and secondly in the maternal stroma as well as in cells of the fetal mesenchyme. This fact speaks for at least two different functions of OPN. 1. OPN could mediate the bovine feto-maternal attachment during the implantation, which was not an object of this study. OPN produced in the glands could be spread on the fetal-maternal interface and act as a bridge molecule between surface receptors (e.g., integrins) of the trophoblast cells and the uterine epithelium. 2. OPN could play an important role as a ligand for the integrin receptors in the maternal stroma and the fetal mesenchyme, thus possibly influencing growth and differentiation of maternal septa and fetal villi.