Entwicklung einer rekombinanten Coxiella burnetii-Vakzine und Überprüfung der Wirksamkeit im Mausmodell

Abstract

Bisherige Versuche zur Etablierung eines C. burnetii-Impfstoffes verliefen wenig erfolgreich, da die Vakzinen zum Teil erhebliche Nebenwirkungen hervorriefen und/oder nicht schützten. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, mittels moderner molekularbiologischer Verfahren eine rekombinante subunit-Vakzine zu entwickeln und deren Wirksamkeit im subletalen Tiermodell zu testen. Zu diesem Zweck wurden acht im Genom von C. burnetii enthaltene orfs mit Übereinstimmungen zu virulenzassoziierten Genen anderer pathogener Bakterienspezies für eine Klonierung in E. coli ausgewählt. Von vier der acht orf-kodierten Proteine (Omp, HspB, CbMip, MucZ) war für C. burnetii bekannt, dass es sich um Proteine der äußeren Zellmembran handelt. Eine membranassoziierte (Fbp) bzw. cytosolische Lokalisation (Pmm, Orf410, Crc) wurde in Analogie zu den Proteinen anderer Bakterienspezies für die übrigen vier C. burnetii-Proteine angenommen. Funktionell gelten sie als Regulatoren (MucZ, Crc), als Integrase/Rekombinase (Orf410), als Hitzeschockprotein (HspB) bzw. als potentiell virulenzsteigernde Proteine (Omp, Pmm, Fbp, CbMip). Nach ihrer Klonierung wurden für drei der acht orfs Abweichungen in der Nukleotidsequenz festgestellt, die bei rOmp einen vorzeitigen Translationsstopp und bei rPmm bzw. rCbMip einen bzw. zwei Aminosäureaustausche bedingten. Im Anschluss an die Überexpression und Aufreinigung der His-tag tragenden Fusionsproteine erfolgte die Überprüfung ihrer Immunogenität. Dabei induzierten mit Ausnahme von rPmm alle rekombinanten C. burnetii-Proteine nach alleiniger bzw. kombinierter Verimpfung an Mäuse unter Verwendung zweier Adjuvatien (Aluminiumhydroxid, Glykolipid BAY R1005) eine humorale Immunantwort. Zudem wiesen die gegen rOmp, rHspB bzw. rCbMip gerichteten Antikörper eine Kreuzreaktivität mit homologen Proteinen in C. burnetii-Ganzzelllysaten auf. Zur Überprüfung der Wirksamkeit der acht rekombinanten C. burnetii-Proteine als subunit-Vakzine wurden Mäuse mit einer Kombination aller acht Fusionsproteine in Verbindung mit dem besser verträglichen Adjuvans BAY R1005 immunisiert und anschließend mit dem C. burnetii-Isolat Nine Mile RSA493 infiziert (1,8 x 108 Partikel/Tier). Dieses subletale Mausmodell erwies sich als gut geeignet, da bereits anhand des klinischen Verlaufes und der Gewichtsentwicklung p. inf. erste Rückschlüsse auf die Wirksamkeit der verwendeten Vakzinen möglich war. Eine Korrelation zeigte sich auch zwischen der Schutzwirkung und den Milzgewichten. Demgegenüber erwies sich die Bestimmung der Leber- bzw. Nierengewichte und die Quantifizierung der C. burnetii-Gehalte in Milz, Leber und Nieren als weniger aussagekräftig. Unter Nutzung der obigen Parameter konnte nur für die Tiere der Vakzinierungskontrolle (Q-Vax ) ein partieller Schutz gegenüber der C. burnetii-Infektion aufgezeigt werden. Für Mäuse, die mit der rekombinanten subunit-Vakzine immunisiert worden waren, ergaben sich weder klinisch noch hinsichtlich der Organgewichte signifikante Unterschiede zu den übrigen Kontrollgruppen. Auch die C. burnetii-Konzentrationen in den Organen waren vergleichbar. Eine Schutzwirkung der rekombinanten C. burnetii-Proteine ließ sich somit nicht nachweisen. Allerdings erwies sich die Verwendung von Proteinkombinationen der Immunisierung mit einzelnen Proteinen als überlegen, da eine humorale Immunantwort gegen ein bestimmtes rekombinantes Protein (rCrc) nur nach Immunisierung mit Proteinkombinationen erfolgte. Previous attempts to develop Q fever vaccines were less successful in that the vaccines caused unacceptable side effects or failed to be protective. So, the aim of this study was to develop a recombinant subunit protein vaccine and to test its efficacy in a sublethal model with mice. Eight orfs of C. burnetii were chosen for cloning in E. coli due to similarities with virulence associated genes of other pathogens. Four of the eight proteins encoded are known to be membrane associated in C. burnetii (Omp, HspB, CbMip and MucZ). For Fbp an association with the outer membrane is also assumed, whereas Pmm, Orf410, and Crc seem to be cytosolic proteins. Functionally, the eight proteins are thought to act either as facultative virulence factors (Omp, Pmm, Fbp, CbMip), as a heat shock protein (HspB), as an integrase/recombinase (Orf410), or as regulatory proteins (Crc, MucZ). Three of the eight orfs cloned showed alterations in the nucleotid sequences, which caused a truncation of rOmp and induced one and two amino acids changes for rPmm and rCbMip, respectively. Subsequent to overexpression in E. coli and purification by affinitychromatography, the immunogenicity of the fusion proteins was tested in mice using Al(OH)3 or the glycolipid BAY R1005 as adjuvants. Except of rPmm, the other seven proteins induced a humoral immune response either after single or combined immunization. Furthermore, antibodies directed against rOmp, rHspB, rCbMip showed cross-reactivity with their homologues in C. burnetii whole cell lysates. For efficacy evaluation, mice were immunized with a combination of the eight recombinant C. burnetii proteins adjuvanted with BAY R1005. Five weeks after the booster immunization, mice were infected intraperitoneally with 1,8 x 108 C. burnetii Nine Mile RSA493 per animal. Subsequently, clinical symptoms, development of body and spleen weights proved to be adequate for indicating the efficacy of vaccination. In contrast, development of liver and kidney weight and enumeration of C. burnetii in spleen, liver, and kidney exhibited no correlation. Using these parameters, only mice vaccinated with Q-Vax were partially protected, whereas animals immunized with the recombinant C. burnetii proteins resembled the mock-vaccinated controls. However, although the recombinant subunit vaccine failed to be protective, the utilization of combinations of recombinant proteins may be crucial for the development of future C. burnetii vaccines. In this study, the humoral immune response was more effective when the mice were immunized with combinations of the recombinant C. burnetii proteins.