Untersuchungen zum Einfluss von alpha Defensinen aus neutrophilen Granulozyten auf die primäre Hämostase

Abstract

Pathogene Mikroorganismen verursachen in der Blutzirkulation oft systemische Erkrankungen, die schnell zum Tod führen können. Angeborene Verteidigungsmechanismen gehören zu den effektivsten Waffen im Kampf gegen solche Infektionen. Thrombozyten sind nicht nur Hauptakteure in der Hämostase, sondern auch spezialisierte Abwehrzellen, die eine Schlüsselrolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen von Entzündungsreaktionen und bei der innaten Immunabwehr spielen. Thrombozyten und Leukozyten interagieren bei der Blutgerinnung und bei Entzündungsreaktionen. Neutrophile sind die zentralen Zellen bei akuten Entzündungsreaktionen. In Sepsissituationen korreliert ihre Aktivität mit der schwere von Organdysfunktionen, die durch hämodynamische Veränderungen hervorgerufen werden. Defensine sind, wie Thrombozyten und Leukozyten maßgeblich an der innaten Immunabwehr beteiligt, sie erkennen und inaktivieren mikrobielle Erreger bevor diese den Körper infizieren und schädigen. Alpha Defensine sind kleine, kationische, cystein- und argininreiche Peptide, die mehr als 40 % der Proteinmenge neutrophiler Leukozyten ausmachen und in deren azurophilen Granula gespeichert sind. Während Entzündungsreaktionen sind sie in das intrazelluläre Töten von Bakterien, Viren und Pilzen involviert und werden von aktivierten Neutrophilen in den Blutstrom und in entzündetes Gewebe freigesetzt. Der Effekt von alpha-Defensinen in Konzentrationen, wie sie im Blut von Sepsis Patienten gefunden wurden, wurde in dieser Arbeit auf verschiedene Thrombozytenfunktionen untersucht. Es zeigte sich, dass alpha Defensine HNP1-3 starke Thrombozytenaktivatoren sind. HNP aktiviert dabei Plättchen direkt und nicht indirekt über eine induzierte Thrombinbildung, was in Koinkubationsversuchen mit Hirudin gezeigt werden konnte. Die Thrombozytenaktivierung wurde durchflußzytometrisch ermitelt. Mit Hilfe der Expressionsmarker CD62 und CD63 konnte gezeigt werden, dass alpha-Defensine Thrombozyten zur vollständige Sekretion ihrer alpha Granula und dense bodies veranlassen. Alpha Defensine befähigen die Thrombozyten Fibrinogen, Thrombospondin-1 und verschiedene Gerinnungsfaktoren auf ihrer Oberfläche zu binden und thrombozytäre Mikropartikel zu bilden. Von CD40L, einem Protein der TNF Familie, welches ein potenter Stimulus für T-Zellen, B-Zellen und Endothelzellen darstellt, wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass es auf der Oberfläche von Plättchen , die durch HNP-1 aktiviert wurden , präsentiert wird und im ELISA konnte die Freisetzung von löslichem CD40L quantifiziert werden. CD40L-CD40 Wechselwirkungen und sCD40L spielen eine zentrale Rolle bei Immunantworten und bei Entzündungsreaktionen und so stellt der Einfluss von alpha-Defensinen auf diese Funktionen ein Bindeglied zur adaptiven Immunantworten dar. Es konnte gezeigt werden, dass alpha-Defensine die Bildung von Assoziaten zwischen Monozyten und Plättchen fördern und das Endothel der Blutgefäße in einen proentzündlichen Funktionszustand versetzen. Der Einfluss, den Thrombozyten auf die Immunabwehr und Entzündungsreaktionen nehmen, wurde lange unterschätzt. Dies ist die erste Beschreibung, dass Peptide der innaten Immunabwehr Thrombozyten aktivieren. Diese neu entdeckten Mechanismen können mitverantwortlich für die Entstehung von Thrombosen in Verbindung mit Entzündungsreaktionen sein. Es wurde nach Ansätzen gesucht diese Gefahr zu hemmen. HNP1-3 binden an Serpine, wie alpha1-Antithombin und Antithombin III. Es wurde in dieser Arbeit untersucht, ob diese Proteine auch dazu fähig sind, die Thrombozytenaktivierung durch HNP zu hemmen. Es zeigte sich, dass alpha1-Antitrypsin and Antithrombin III die Thrombozytenaktivierung dosisabhängig und vollständig zu hemmen vermochten. Antithombin III war ein potenter Inhibitor der nicht-thrombin-bedingten Plättchenaktivierung durch HNP. Dieser beobachtete Effekt unterstreicht die antithrombotische und antientzündliche Wirkung, die in Tierstudien schon oft mit ATIII beobachtet wurden. Auch a2 Makroglobuline hemmten die Plättchenaktivierung durch HNP-1. Von a2 Makroglobulin weiß man, dass es über Thiole an HNP bindet. Es wurde weiter in dieser Arbeit beobachtet, dass auch Thrombospondin-1, Vitronektin und der PDI Blocker Bacitracin die HNP induzierte Plättchenaktivierung hemmten und so wurde hier eine Abhängigkeit bei der Thrombozytenaktivierung durch HNP von Thiol-Disulfid-Isomerierungen vermutet. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass HNPs allosterische Disulfide beinhalten. Die Klärung des Mechanismus, wie HNPs die Plättchen aktivieren, erfordert noch weitere Untersuchungen, es ergeben sich aber Hinweise, dass HNP die Plättchenmembran permeabilisiert, da gezeigt werden konnte, dass es Calcein AM durchlässige Poren in die Plättchenmembran formt. Ein besseres Verstehen der Interaktionen von alpha Defensinen, Thrombozyten, Leukozyten und dem Endothel könnte Ansätze für neue Therapiemöglichkeiten liefern, wenn die Abwehr Amok läuft. Pathogenic micro-organisms often cause severe systemic infectious diseases if they reach the bloodstream. Innate immune defence mechanisms are very fast and one of the most effective weapons against infections. Platelets, known as primary actors in haemostasis, are specialized immune cells that play central roles in physiologic and pathologic processes of haemostasis, inflammation, tumour metastasis, wound healing and innate host defence. Platelets and leukocytes interact in haemostasis and inflammation. Neutrophils are the central cells in acute inflammation. The neutrophilic activation in human sepsis correlates with the severity of organ dysfunction followed by haemodynamic changes. Defensines are like platelets and leukocytes important constituents of the innate immune system, which recognises and inactivates microbial pathogens once they attempt to infect and colonise the host tissue. Neutrophil defensins, cationic, small cystein- and arginine-rich peptides that comprise about 40 % of the total protein content of azurophilic granules, attack bacteria, fungi, viruses and parasites. They are released upon neutrophil activation by exocytosis. The effect of alpha defensins in concentrations, which have been found in the plasma of septic patients, on different platelet functions was examined. We observed, that the alpha defensins HNP-1, HNP-2 and HNP-3, in concentrations that are secreted in the neighbourhood of activated neutrophils, are very strong platelet agonists and induce full platelet activation. HNP-1, HNP-2 and HNP-3 activated the platelets directly and not indirectly via thrombin formation. The addition of hirudin had no effect on alpha-defensin induced platelet activation. Activation of platelets by HNP-1 to 3 was assessed by flow cytometry. We analysed among other things, CD62 expression as a marker of alpha-granule secretion, CD63 expression as a marker of dense body secretion, and binding of fibrinogen, thrombospondin-1 and several coagulation factors to the platelet surface as well as platelet microparticle formation. In addition, alpha defensin induced platelet activation led to platelet surface expression of CD40L, a protein belonging to the TNF family, that stimulates dendritic cells, B cells and endothelium cells. Soluble CD40L was quantified by ELISA. In that way alpha defensins might amplify haemostasis, inflammation and even the adaptive immune response. Further they stimulated the formation of platelet-monocyte associates and augmented the (pro)inflammatory activity of vascular cells. Platelets are underappreciated concerning their contributions to host defence and inflammatory processes. This is the first description that peptides of the innate immune system activate platelets. This new discovered mechanism might be at least in part responsible for the formation of thrombi in connection with inflammatory processes. Possibilities to inhibit these action of the alpha defensins were studied. HNP1 to 3 strongly bind to serpins like alpha1-antitrypsin and antithrombin III. Therefore we tested whether these protease inhibitors might have an additional function and might be able to inhibit the activation of platelets by alpha defensins. Alpha1-antitrypsin and antithrombin III inhibited platelet activation in a dose dependent manner. Antithrombin III showed to be a potent inhibitor of alpha defensin induced platelet activation. This inhibition was not dependent on heparin. These observed effect of antithombin III might contribute to its antithromotic and anti-inflammatory potential seen in animal studies. The activation of haemostasis by alpha defensins was also inhibited by a2 macroglobulin. It is known that a2 macroglobulin binds HNP via thiols. In addition to that I observed that also thrombospondin-1, vitronectin, and bacitracin inhibit the activation of platelets induced by HNP. I therefore propose that the activation of platelets by HNP is dependent on a thiol disulfid-isomeration. The mechanism, how HNPs activate the platelets, requires further examinations. There are however indications that HNP permeabilises the platelet membrane as it could be shown, that they form pores permeable for calcein AM into the platelet membrane. A better understanding of the interaction of alpha defensins, platelets, leukocytes and the endothelium could provide new targets for the treatment, when the defence system runs amok.