Isolierung und Charakterisierung equiner mesenchymaler Stammzellen für einen möglichen Einsatz im Tissue Engineering

Abstract

Osteoarthritiden und Sehnenverletzungen sind häufige Gründe für eine erhöhte Morbidität und verminderte Leistungsfähigkeit bei Pferden oder Kleintieren.Aufgrund des langen Zeitraums, die das Gewebe für die Eigenregeneration benötigt, ist eine Auswahl an Therapiemöglichkeiten mit niedrigerer Regenerationszeit und somit mit schnellerer Belastbarkeit der Strukturen unabdingbar. Zu den mittlerweile gebräuchlichen Therapieansätzen, die sich von der konservativen Therapie bis hin zu Ersatzmaterialien belaufen, wäre es eine interessante und vorteilhafte Alternative, körpereigene Zellen aufzuarbeiten und diese in Form eines Transplantates in den Defekt einzubringen. Zu den möglichen körpereigenen Zellen gehören mesenchymale Stammzellen (MSC) aus dem Knochenmark. Das Ziel dieser Studie war, die aus dem Pferd gewonnenen und isolierten equinen Mesenchymalen Stammzellen (eMSC) näher zu charakterisieren. Um die Potenz der MSC´s für einen therapeutischen Einsatz zu untersuchen, wurden morphologische Untersuchungen mit diesen isolierten Stammzellen ex vivo durchgeführt und anschließend beurteilt.Nach Trennung der Knochenmarkflüssigkeit in ihre Bestandteile, Zellen, Blut und Restbestandteile, konnten die Zellen in einer Zellkultur aufgereinigt und expandiert werden. Im Zuge der Expansion wurden verschiedene Seren und Medien, zu Anreicherung, im Hinblick auf Proliferation getestet. Zur Beurteilung des Proliferationsverhaltens wurde ein Colony Forming Unit Assay (CFU-Assay) durchgeführt. Anhand diesem sollte gezeigt werden, wie sich das Koloniewachstum in Abhängigkeit der Zellzahl entwickelt. Um das Proliferationspotential, sowohl im Moment der Zellteilung, als auch in einem Zeitraum von 24 Stunden darzustellen, wurden die Zellen mit Ki 67 zum Zeitpunkt der Fixierung und mit BrDU über 24 Stunden konfrontiert.Nach erfolgreicher Isolation und Expansion, wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Diesen Vorgang überstanden die Zellen ohne Alterationen aufzuweisen. Selbst nach einer Kryokonservierung von 1,5 Jahren stellten sich die Zellen unverändert dar. Zur Überprüfung der Vitalität der Zellen wurden die eMSC bei unterschiedlichen Bedingungen, zum einen auf Eis und zum anderen bei 4° C, gelagert. Bei diesem Versuchsaufbau sollte geklärt werden, ob es eine Möglichkeit ist, die Zellen gekühlt zur Tierarztpraxis/-klinik zu senden. Dabei stellte sich heraus, daß eine Lagerung der Zellen unter beiden Bedingungen für zwei Tage mit nur geringem Zellverlust möglich ist. Da bekannt ist, daß im Knochenmark eine niedrige Sauerstoffspannung herrscht, wurden die Kulturbedingungen dahingehend variiert, daß der Sauerstoffgehalt von 21% auf 3% in einer Hypoxiekammer herabgesetzt wurde. Die dadurch gesteigerte Proliferationsfähigkeit der eMSC konnte sowohl mit Ki 67 als auch mit BrDU visualisiert werden. Auf den Stammzellmarker THY 1 / CD 90, der in anderen morpholgischen Studien routinemäßig eingesetzt wird, reagierten die Zellen positiv. Ein weiterer Stammzellmarker, Oct 4, konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden.Im Rahmen einer immunhistochemischen Charakterisierung konnte der Nachweis erbracht werden, daß die Zellen in ihrer Extrazellularmatrix (EZM) Fibronektin, Perlecan, Aggrecan und Kollagen IV exprimieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß die Interaktion mit der Extrazellularmatrix über das transmembranäre Protein ß1 Integrin erfolgt.Weitere Untersuchungen hinsichtlich der Pluripotenz der eMSC zeigten die Differenzierbarkeit der Zellen in die verschiedenen Richtungen wie Fett, Knorpel und Knochen, sowohl vor wie nach der Kryokonservierung. Untersuchungen zum Migrationsverhalten zeigten, daß eine deutliche Zellmotilität vorhanden war. Dies wurde mit Hilfe einer Phalloidin-Färbung visualisiert. Die Migration der Zellen konnte durch Zugabe von Interleukin 6 positiv beeinflußt werden. Die Transduktion der Zellen, mit einem adenoviralen Vektor, mit der Sequenz für das grün fluoreszierende Protein (GFP), zur Markierung der Zellen, konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Diese Markierung soll bei einer späteren Detektion der Zellen im Zielgewebe helfen. Im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz im tissue engineering ist die Kultivierung auf verschiedenen Trägermaterialien untersucht worden. Auf allen getesteten Trägermaterialien (Kollagen-Gel, Microcarrier und Fibrinkügelchen) war eine Kultivierung für mindestens drei Wochen möglich, ohne daß die Vitalität der Zelle abnimmt. Desweiteren wurden die Zellen in einer Rotationskultur auf Microcarriern kultiviert, einer Versuchsanordnung, die die Schwerelosigkeit imitiert und eine gleichmäßige Versorgung der Zellen garantiert. Der therapeutischer Einsatz von entnommenen, isolierten und expandierten Zellen wurde bereits erfolgreich durchgeführt. Mit Hilfe der Zellinjektion konnte ultrasonographisch eine verbesserte Durchbauung eines Sehnendefektes nachgewiesen werden. Die Pferde, bei denen eine solche Zellinjektion stattgefunden hatte, zeigten eine deutliche Besserung, bis hin zum Verschwinden, der klinischen Symptome. Der klinische Einsatz von mit Zellen beschickten Trägermaterialen soll noch in weiterführenden Studien getestet werden. Osteoarthritis and tendon injuries are often the reason for a high morbidity rate and a reduced ability in horses and small animals.Due to the long regeneration phase that is required by the tissue for self-renewal, a range of critical options with a shorter regeneration phase enabling a swifter recovery is indispensable. In addition to conventional therapy practice ranging from the more classical methods as well as the use of substitute materials, an interesting alternative would be to process autologous cells with the aim to transplant them into the injured tissues. For this purpose mesenchymal stem cells (MSC) isolated from the bone marrow stroma would be an autologous cell source.The purpose of this paper is to further characterize mesenchymal stem cells (eMSC) from horses. In order to examine the potency of MSCs for therapeutic purposes, morphologic examinations with isolated stem cells ex vivo were carried out and evaluated. The cells were isolated from the bone marrow fluid with the aim of cultivation and expansion in the cell culture laboratory.During the expansion period different serumbatches and methods for accumulation were tested with regards to their impact on proliferation. To evaluate the characteristics of proliferation a colony forming unit assay (CFU assay) was performed.To show the characteristics of proliferation in both, the moment of cell division and the period of 24 hours, proliferation marker Ki 67 was applied at the time of fixation as was Bromodeoxyuridine (BrDU) over the period of 24 hours. After a successful isolation und expansion, the cells were cryoconserved in liquid nitrogen. The cells survived the treatment without alteration. Even after cryoconservation for up to 1.5 years, the cells remained unaltered.To examine the vitality of the cells the eMSC were stored under different conditions both, on ice and at 4° C. This experimental setup was to approve the possibility to transport refrigerated cells to the veterinarians practice / clinic . Both methods approved that storage for two days is possible with only a limited loss of cells. Since the oxygen content in the bone marrow is lower than in the sorrounding tissue, the cell culture conditions were adjusted by reducing the oxygen concentration accordingly from 21% to only 3%. The effect was achieved by reducing the oxygen content in a hypoxy chamber. The visualization of the proliferation potential was achieved using the BrDU assay or immunocytochemically with the Ki 67 proliferation marker.The eMSCs were immunopositive for the stem cell marker CD 90 furthermore the stem cell marker Oct-4 could be detected using RT-PCR.Stem cell characteristics were investigated immunocytochemically by detecting the expression of Fibronectin, Perlecan, Aggrecan and Collagen IV as a part of its extracellular matrix (ECM).Further on, it could be shown that the interaction of cells with its ECM is regulated via the transmembrane protein ß1-Integrin. Test results about the pluripotency of cells showed the differentiation between fat, cartilage and bone was successful before and even after cyroconservation. Studies on the migratory behavior proved that cells can be stimulated to perform a cell motility. The visualization of the migration was achieved using the phalloidin staining. Furthermore, the migration of the cells was positively influenced by the addition of Interleukin 6. The transduction of the cells with an adenoviral vector, with the GFP sequence to mark the cells, was also carried out successfully. The transduction was carried out in order to support the future detection of cells in the tissue of the recipient. Cultivation on different carrier materials was intended with regard to a therapeutic application in tissue engineering. Cultivation of cells on all carrier materials tested (collagen gel, collagen micro carriers and the fibrin sealant Tissucol) was possible and the viability of cells could be demonstrated for up to 3 weeks. Furthermore, the cells were cultivated in a rotary cell culture system on microcarriers, a test arrangement which imitates microgravity and ensures an optimal supply of trophic substances.The therapeutic application of extracted, isolated and expandated cells had been carried out successfully.The application of this treatment made a recovery of the tendon damage possible and outlined ultrasonographically.The tests on horses that had received an injection of cells over nine month observation period showed a definite improvement and in some cases even a disappearance of the clinical symptoms.The clinical application of carrier materials has yet to be tested.