Periurethrale Injektion adulter mesenchymaler Stammzellen als neuer Therapieansatz zur Behandlung der Belastungsinkontinenz im Rattenmodell

Abstract

Belastungsinkontinenz wird durch morphologische und funktionale Defekte des Harnblasensphinkters durch Operationen oder vaginale Geburten sowie durch eine mit dem Lebensalter korrelierte Abnahme von Zellen des Rhabdosphinkters infolge physiologischer Apoptose verursacht. Mesenchymale Stammzellen (MSZ) haben das Potential, in Muskelzellen zu differenzieren. Sie sind deshalb für eine zellbasierte Therapie der Belastungsinkontinenz von Interesse. Das Ziel der Studie sind Untersuchungen an murinen MSZ (mMSZ) und humanen MSZ (hMSZ) aus dem Knochenmark zur myogenen Differenzierung in vitro und zur Integration von in den Blasenhals transplantierten MSZ bzw. hieraus differenzierten Muskelzellen in einem syngenen und xenogenen Rattenmodell. Nach Isolierung von mMSZ aus dem Knochenmark durch Plastikadhärenz werden diese in Passage (P) 1 für die Induktion myogener Zellen 24 Stunden gegenüber 5-Azazytidin (5-Aza) exponiert. Zellen in P2 und P3 werden mit monoklonalen Antikörpern auf die Expression myogener Marker immuncytochemisch untersucht. Glattmuskuläres alpha-Aktin (Klon 1A4) ist in 50-90 % und alpha/gamma-Aktin (Klon CGA7) in 20 % der Zellen exprimiert. Der Nachweis skelettmuskulärer Marker ergibt mit einem Antikörper gegen MyoD (Klon MoAb5.8A) eine Reaktion in einzelnen Zellen. Die Expression von Myosin (Klon NOQ 7.5.4D) kann nicht nachgewiesen werden. Somit werden mMSZ bei einer Exposition gegenüber 5-Aza in vitro insbesondere in glattmuskuläre Zellen differenziert. Die Kontrollen zeigen eine vergleichbare Expression der myogenen Marker. Für den Nachweis in vivo werden die zur myogenen Differenzierung behandelten mMSZ mit dem Vitalfarbstoff PKH 26 markiert und direkt in den Blasenhals der Versuchstiere gespritzt. Die Integration wird nach 2, 58, 65, 135 und 163 Tagen hitologisch und immunhistochemisch mit den gleichen Antikörpern wie in der Immuncytochemie untersucht. Die transplantierten Zellen kann für jeden Versuchszeitpunkt nachgewiesen werden. In einzelnen Tieren kann nach 58 Tagen auch eine gleichmäßige Verteilung im Blasenhalsgewebe festgestellt werden. In den Gewebeschnitten von drei Ratten kann ein glattmuskulärer Phänotyp den injizierten Zellen zugeordnet werden. Entzündungsreaktionen und Tumorbildungen werden nicht beobachtet. Nach Isolierung von hMSZ aus dem Knochenmark durch Plastikadhärenz werden konfluente Kulturen in P1 für 24 Stunden mit 5-Aza differenziert. Die Expression von glattmuskulärem alpha-Aktin und alpha/gamma-Aktin sowie skelettmuskulärem MyoD und Myosin wird immuncytochemisch in P2 bis P6 und in unbehandelten Kontrollen in P0 bis P6 untersucht. Für den Nachweis der direkt in den Blasenhals immundefizienter Nacktratten injizierten hMSZ werden diese direkt vor der Applikation ebenfalls mit PKH 26 markiert. Die Integration in das Zielgewebe wird nach 56 Tagen und bei den Kontrollen mit nativen hMSZ auch nach 4, 8, 12 und 28 Tagen histologisch überprüft und die integrierten hMSZ immunologisch charakterisiert. Die Histologie zeigt gut abgrenzbare Gruppen transplantierter Zellen in den Geweben des Blasenhalses über den gesamten Versuchszeitraum. Entzündungsreaktionen und tumoröse Entartungen werden nicht nachgewiesen. Glattmuskuläres alpha-Aktin und alpha/gamma-Aktin sowie skelettmuskuläres MyoD werden in nicht gegenüber 5-Aza exponierten MSZ in P0 in 62 %, 60 % bzw. 73 % und in P1 in 94 %, 100 % bzw. 92 % nachgewiesen; in P2 bis P6 ist nur noch alpha-Aktin exprimiert (65-84 %). Hingegen zeigen gegenüber 5-Aza exponierte hMSZ für diese Marker einheitliche Expressionsmuster in P2 bis P6 mit einem Nachweis von alpha-Aktin in 86-97 %, alpha/gamma-Aktin in 81-100 % und MyoD in 63-100 % der Zellen. Skelettmuskuläres Myosin ist in beiden Gruppen nicht nachweisbar. In der Immunhistochemie der Präparate können muskuläre Antigene nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Untersuchungen zur Differenzierung von hMSZ aus dem Knochenmark in glatte- und Skelettmuskelzellen zeigen, dass eine Exposition gegenüber 5-Aza nicht notwendig ist. Allerdings ist sie für eine dauerhafte Expression in vitro erforderlich. Die Tiermodelle unterstreichen die Verwendung autologer MSZ für die Behandlung der Belastungsinkontinenz beim Menschen und ebenso auch beim Tier. In weiteren Studien werden die myogene Differenzierung in vivo und die Integration in den Rhabdosphinkter in einem xenogenen Großtiermodell genauer erforscht wobei auch Untersuchungen zur Verbesserung der Sphinkterfunktion durchgeführt werden. Urinary incontinence is caused by morphological and functional defects of the sphincteric muscle, which are a result of surgery, vaginal birth, as well as an age-dependent decline of rhabdosphincter cells caused by physiological apoptosis. Mesenchymal stem cells (MSC) have the potential to differentiate into muscle cells. Therefore, they are of interest for a cell-based therapy of urinary incontinence. The aim of this study is to examine myogenic differentiation in vitro of bone marrow-derived murine MSC (mMSC) and human MSC (hMSC) and the integration of the MSC or therefrom differentiated muscle cells transplanted into the bladder neck in a syngenic and xenogenic rat model. Bone marrow-derived mMSC are isolated by plastic adherence. To induce myogenic differentiation mMSC in culture passage (P) 1 are exposed for 24 hours to 5-azacytidin (5-Aza). Cells in P2 and P3 are examined by immunocytochemistry with monoclonal antibodies for the expression of myogenic markers. Smooth muscle alpha-actin (clone 1A4) is identifed in 50-90 %. Smooth muscle alpha/gamma-actin (clone CGA7) is expressed in 20 % of the cells. The detection of skeletal muscle antigen with an antibody against skeletal muscle MyoD (clone MoAb5.8A) results in a reaction in individual cells. The expression of skeletal slow muscle myosin (clone NOQ 7.5.4D) can not be detected. Therefore, the mMSC are differentiated particularly in smooth muscle cells by exposure to 5-Aza in vitro. The controls revealed a similar expression pattern of the myogenic markers. For the verification in vivo the mMSC treated for myogenic differenciation are marked with PKH 26, a red fluorescent cell linker, and injected directly into the bladder neck of the experimental animals. The integration is examined histologically after 2, 58, 65, 135, and 163 days. The rats bladders are examined histologically and immunohistochemically, using the same antibodies as in immunocytochemistry. The transplanted cells can be detected for every given point in time throughout the experiment. After 58 days it is also possible to detect an even distribution in the bladder neck tissue of individual animals. In the bladder neck tissue of three rats a smooth muscle phenotype can be allocated to the injected cells. There is neither inflammation nor tumourous malformation in the target tissue. Bone marrow-derived hMSC are isolated by the method of plastic adherence. Confluent cultures in P1 are differentiated with 5-Aza for 24 hours. The expression of smooth muscle alpha-actin and alpha/gamma-actin, as well as skeletal muscle MyoD and myosin is examined immunocytochemically in P2 to P6 and in untreated controls in P0 to P6. For the detection of the directly injected hMSC into the bladder neck of athymic nude rats, the cells are also marked with PKH 26 prior to the injection. The integration into the host tissue is examined histologically after 56 days, whereas the controls with native hMSC are also examined after 4, 8, 12, and 28 days. The integrated hMSC are characterised immunohistologically. The histology shows well-defined groups of transplanted cells in the bladder neck tissue over the entire period of the experiment. Inflammation or tumourous tissue are not found. Smooth muscle alpha-actin and alpha/gamma-actin as well as skeletal muscle MyoD is detected in MSC not exposed to 5-Aza in P0 in 62 %, 60 % and 73 %, respectively of the cells and is detected in P1 in 94 %, 100 %, and 92 %, respectively of the cells. In P2 to P6 only alpha-actin is expressed (65-84 %). However, hMSC exposed to 5-Aza show a consistent expression pattern from P2 to P6 with a verification of alpha-actin in 86-97 %, alpha/gamma-actin in 81-100 %, and MyoD in 63-100 % of the cells. Skeletal muscle myosin is not detected in both groups. In the immunohistochemistry for the histological specimens, there is no explicit evidence for muscular antigens. The examination, that is carried out in order to differentiate bone marrow-derived hMSC into smooth muscle and skeletal muscle cells shows, that an exposure to 5-Aza is not necessary. However, it is found that an exposure to 5-Aza is essential for a permanent expression in vitro. The animal models highlight the use of autologous MSC for treating urinary incontinence in human beings, as well as in animals. Further studies will investigate the myogenic differentiation in vivo and the integration into the rhabdosphincter in a xenogenic large animal model. In conducting such further studies an examination into the improvement of the function of the sphincteric muscle will be a key component.