Molekulare Untersuchungen an mutmaßlichen Virulenzmechanismen und Antibiotikaresistenzen von Bakterien der Gattung Staphylococcus

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen konnten S. aureus-, S. intermedius- und S. hyicus-Kulturen unterschiedlicher Herkunft zunächst durch phänotypische und genotypische Eigenschaften identifiziert und anschließend weitergehend, unter besonderer Berücksichtigung der Exfoliativen Toxingene, charakterisiert werden. Aufgrund der unklaren taxonomischen Stellung und einer fehlenden Abgrenzung gegenüber S. pseudintermedius wurden die S. intermedius-Kulturen der vorliegenden Untersuchungen als S. intermedius-Gruppe (SIG) bezeichnet. Eine Differenzierung der Staphylokokkenkulturen war aufgrund von kulturellen Eigenschaften, durch Nachweis der Hämolyseformen, der Koagulasereaktion und verschiedener anderer biochemischer Kriterien möglich. Eine molekulare Identifizierung der S. aureus-Kulturen erfolgte durch PCR-vermittelten Nachweis des Thermonuklease-kodierenden Gens nuc, des S. aureus-spezifischen Abschnitts Sa442 innerhalb der chromosomalen DNA und des Protein A-kodierenden Gens spa, der SIG-Kulturen durch Nachweis des Thermonuklease-kodierenden Gens nuc und eines speziesspezifischen Abschnitts des Co-Chaperon-DnaJ-kodierenden Gens dnaJ und der S. hyicus-Kulturen durch Nachweis des Superoxid Dismutase A-kodierenden Gens sodA und eines S. hyicus-spezifischen Abschnitts der 16S-23S rDNA intergenic spacer Region.Die Etablierung eines PCR-vermittelten Nachweissystems für Exfoliative Toxingene ergab für S. aureus, isoliert vom Menschen, nicht aber vom Tier, den vereinzelten Nachweis der ETA- und ETB-kodierenden Gene eta und etb, für SIG bei nahezu allen untersuchten Kulturen den Nachweis des SIET-kodierenden Gens siet und für S. hyicus den Nachweis der Exfoliativen Toxine ExhC-, ExhD- und SHETA-kodierenden Gene exhC, exhD und sheta. Der Nachweis der Exfoliativen Toxingene bei S. hyicus schien mit dem Krankheitsbild der Exsudativen Epidermitis korreliert zu sein. Die Bedeutung des bei nahezu allen SIG-Kulturen vorkommenden Toxingens siet ist bislang noch unklar. Für S. aureus-Isolate vom Menschen und erstmalig bei S. aureus-Isolaten vom Tier konnte im weiteren das Chemotaxis inhibiting Protein-kodierende Gen chp nachgewiesen werden. Eine weitergehende Charakterisierung der SIG war durch Nachweis der Enterotoxin-, Leukotoxin-, Adenylsuccinatlyase- und Chemotaxis inhibiting Protein-kodierenden Gene se-int, lukS, lukF, purB und chp möglich. Bei ausgewählten SIG-Kulturen waren ferner die gemeinsam auftretenden Resistenzgene gegenüber Penicillin und Methicillin blaZ und mecA feststellbar. Diese ausgewählten SIG-Kulturen zeigten einen identischen DNA-Fingerprint, was auf die Verbreitung eines einheitlichen Methicillin-resistenten Bakterienklons in der Hunde und Katzenpopulation hindeutet.Die in den vorliegenden Untersuchungen vorgestellten PCR-vermittelten Nachweissysteme ermöglichten eine eindeutige Identifizierung und, insbesondere für SIG und S. hyicus, eine weitergehende Charakterisierung hinsichtlich des Vorkommens mutmaßlicher Toxin- und Resistenzgene. Der Nachweis unterschiedlicher Genausstattungen bei S. aureus, SIG und S. hyicus durch die teilweise erstmals vorgestellten molekularen Nachweisverfahren könnte zu einer Abschätzung des krankmachenden Potentials einzelner Staphylokokkenstämme beitragen und letztlich eine Erklärung für das jeweilige Krankheitsbild bei Tier und Mensch geben. Within the framework of the present study, S. aureus-, S. intermedius- und S. hyicus-cultures of different origins could be firstly identified through phenotypic and genotypic properties and further characterized with the exfoliative toxingenes been taken under consideration. As a result of the unclear taxonomic situation and a missing border opposite to S. pseudintermedius, the S. intermedius-cultures of the present study, were characterized as S. intermedius-Group (SIG). A differentiation of the staphylococcal cultures was based on cultural properties, through proving hemolysis forms, the coagulase reaction and other biochemical criteria. A molecular identification of S. aureus-cultures was carried out through PCR-mediated detection of the thermonuclease-encoding gene nuc, of the S. aureus-specific section Sa442 within the chromosomal DNA and the protein A-encoding gen spa, the SIG-cultures by detection of the thermonuclease encoding gene nuc and a specific part of the Co-Chaperon-DnaJ-encoding gene dnaJ and the S. hyicus-cultures by detection of the superoxide Dimutase A-encoding gene sodA and a S. hyicus-specific section of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region. Establishment of PCR-mediated detection-systems for exfoliative toxingenes has shown for S. aureus, isolated from man, not from animal, the separate proof of the ETA-and ETB-encoding gens eta and etb for SIG for almost all tested cultures the evidence of SIET-encoding gene siet and for S.hyicus the evidence of the exfoliative toxins ExhC-, ExhD- und SHETA-encoding genes exhC, exhD and sheta. Evidence of the exfoliative toxingenes in S. hyicus seemed to be correlated with clinical picture of the disease exudative epidermitis. The significance of the occurring toxingenes siet in almost all SIG-cultures is so far vague. For S. aureus-isolates from man and for the first time for S. aureus-isolates from animal, the chemotaxis inhibiting protein- encoding gene chp could be furthermore identified. A further characterization of the SIG was possible through identifying the enterotoxin-, leucotoxin-adenylsuccinatlyase- and chemotaxis-inhibiting protein-encoding genes se-int, lukS, lukF, purB and chp. In selected SIG-cultures the commonly occurring resistence-genes against penicillin und methicillin blaZ und mecA were detectable. These selected SIG-cultures showed an identical DNA-fingerprint, pointing to the spread of a unique methicillin-resistant bacterial clone in dog and cat population. The PCR-mediated detection systems presented in this study have enabled a definite identification and, particularly for SIG and S. hyicus, a further characterization regarding the appearance of supposable toxin- und resistence gene. The recognition of differient gene configurations, in S. aureus, SIG and S. hyicus through the partially for the first time presented molecular evidence process could help an estimation of the pathogenic potentials of single staphylococcus strains and finally an explanation for the particular disease symptoms in animal and man.