Entwicklung und Validierung eines Sandwich-Enzymimmuntests zum Nachweis von bovinem ZNS in Fleisch und Fleischerzeugnissen

Abstract

Es wurde ein enzymimmunologisches Verfahren nach dem Sandwich-Prinzip zum Nachweis von Rinder-ZNS in Fleisch und Fleischerzeugnissen entwickelt. Das Verfahren basiert auf dem Nachweis von GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), dem Hauptbestandteil der Gliafilamente, mittels polyklonaler Antikörper.Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen bovines GFAP wurden drei Kaninchen, zwei Schafe und zwei Schweine immunisiert. In allen Tieren konnte eine spezifische Immunantwort induziert werden. Die gewonnenen Antiseren wurden gereinigt und zur Herstellung von Antikörper-Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugaten verwendet. Die 49 möglichen Kombinationen aus Antiseren und Antikörper-HRP-Konjugaten wurden mittels GFAP und ZNS von Rind und Schwein insbesondere hinsichtlich ihrer Tierartspezifität überprüft. Die zum Nachweis von bovinem ZNS geeignetste Kombination aus Antiserum und Antikörper-HRP-Konjugat wurde ausgewählt und die optimale Konzentration der Immunreagenzien ermittelt. Die Nachweisgrenze für bovines GFAP lag unter diesen Bedingungen zwischen 4,1 und 12,3 ng/ml.Zur Ermittlung der optimalen Probenaufbereitung von Fleisch- und Fleischerzeugnissen wurden verschiedene Extraktionsmittel, Temperatur-Zeit-Kombinationen und Verdünnungsmedien miteinander verglichen. Die Probenaufbereitung, die die höchsten Extinktionen ergab, wurde verwendet, um aus ZNS einen internen Gehirnstandard zur direkten Quantifizierung des ZNS-Gehaltes in Proben zu erstellen. Unter diesen Bedingungen lag die Nachweisgrenze bei 1-3 µg Gehirnäquivalent (GÄq) / ml Extrakt.Die Überprüfung der Testsensitivität für den Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen erfolgte durch Untersuchung künstlich mit Rindergehirn und rückenmark kontaminierter roher und erhitzter Fleischerzeugnisse: rohe Fleischerzeugnisse, die mindestens 0,5 % Rindergehirn oder 0,1 % -rückenmark enthielten, ergaben im Enzymimmuntest stets ein Messsignal oberhalb der Nachweisgrenze. Die Wiederfindungsraten für Rindergehirn betrugen durchschnittlich 86 % in rohen und 94 % in erhitzten Fleischerzeugnissen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Rinderrückenmark betrug das 5,5-fache der durchschnittlichen Wiederfindungsrate für Rindergehirn.Zur Überprüfung der Tierartspezifität des Enzymimmuntests in Fleischerzeugnissen wurden rohe und erhitzte Fleischerzeugnisse mit definierten Mengen ZNS verschiedener Tierarten versetzt. Kontaminierte Proben mit mind. 1 % Schweinegehirn, 0,5 % Schweinerückenmark und 0,5 % Kaninchen-, Schafs- oder Pferdegehirn ergaben jeweils ein Messsignal oberhalb der Nachweisgrenze. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Schweinegehirn betrug ca. 1/3 der durchschnittlichen Wiederfindungsrate für Rindergehirn, während die Wiederfindungsraten für Schafgehirn geringgradig höher und für Pferde- und Kaninchengehirn geringgradig niedriger als für Rindergehirn waren. Mit Hühner- oder Putengehirn kontaminierte Proben ergaben keine Messsignale oberhalb der Nachweisgrenze.Der entwickelte Sandwich-Enzymimmuntest wurde mit einem kommerziell erhältlichen Enzymimmuntest zum Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen, dem RIDASCREEN Risk Material Test von R-Biopharm, der ebenfalls bovines GFAP als Markerprotein verwendet, verglichen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate betrug für Rindergehirn 82 % in rohen und 29 % in erhitzten Fleischerzeugnissen. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate für Schweinegehirn betrug 103 %. Für Schafsgehirn war die Wiederfindungsrate ca. doppelt so hoch wie für Rindergehirn, die Wiederfindungsraten für Kaninchen- und Pferdegehirn lagen bei ca. 1/3 der Wiederfindungsraten für Rindergehirn.Für die Überprüfung der Anwendbarkeit des Testsystems zur Untersuchung von Fleischerzeugnissen aus dem Handel auf ZNS-Kontamination wurden 30 Wurstwaren untersucht und ein Teil der Extrakte auch künstlich mit ZNS-Extrakt kontaminiert. In keiner der untersuchten Proben konnte ZNS nachgewiesen werden, die in künstlich kontaminierten Extrakten ermittelten Wiederfindungsraten betrugen zwischen 64 und 121 %.Durch immunaffinitätschromatographische Aufreinigung der Antiseren mit an Sepharose gekoppeltem bovinem und porcinem GFAP wurde versucht, eine weitere Spezifitätssteigerung zu erzielen. Sowohl die gereinigten Eluate der über boviner-GFAP-Sepharose getrennten Antiseren als auch die Probendurchläufe der Säule mit porciner-GFAP-Sepharose (subtraktive Immunaffinitätschromatographie) zeigten im indirekten Enzymimmuntest und im Sandwich-Enzymimmuntest keine Verbesserung der Speziesspezifität gegenüber den nicht aufgereinigten Antiseren. A sandwich enzyme immunoassay (EIA) for the detection of bovine tissue from the central nervous system (CNS) in meat and meat products was developed. The test is based on the detection of GFAP (glial fibrillary acidic protein), the major protein constituent of glial filaments, by polyclonal antibodies.In order to produce polyclonal antibodies against bovine GFAP, three rabbits, two sheep and two pigs were immunized. A specific immunoresponse could be induced in all animals. The gained antisera were purified and used to prepare antibody-horse-radish-peroxidase (HRP) conjugates. All 49 possible combinations of antisera and antibody-HRP-conjucates were examined with regard to their species specificity with GFAP and CNS of cattle and pig. The most suitable combination of antiserum and antibody-HRP-conjucate was chosen and the optimal concentration of immunoreagents was determined. On these conditions the detection limit for bovine GFAP was between 4.1 and 12.3 ng/ml.In order to establish a suitable sample preparation for meat and meat products, different extraction media, temperature-time combinations and dilution media were compared. The sample preparation which yielded the highest measurement signal was used to produce an internal brain-standard with bovine CNS in order to quantify CNS contents in samples directly. On these conditions the detection limit was beteen 1 and 3 µg brain-equivalent per ml extract.The sensitivity of the EIA for the detection of CNS in meat products was examined by analyzing raw and heated samples which were artificially contaminated with bovine brain or spinal cord: raw meat products with at least 0.5 % bovine brain or 0.1 % bovine spinal cord yielded always signals above the detection limit. The mean recovery rates of bovine brain were 86 % in raw and 94 % in heated meat products. The mean recovery rate of bovine spinal cord was about 5.5 fold higher than those of bovine brain.In order to examine the species specificity of the EIA in meat products, raw and heated meat products were artificially contaminated with CNS of different animal species. Contaminated samples with at least 1 % porcine brain, 0.5 % porcine spinal cord or 0.5 % sheep, horse or rabbit brain yielded always signals above the detection limit. The mean recovery of porcine brain was one third of the mean recovery of bovine brain while the recovery rates of ovine brain were slightly higher and these of horse and rabbit brain were slightly lower than the recovery rates of bovine brain. If brain of chicken or turkey was used to contaminate meat products, no signal above the detection limit could be found.The developed sandwich EIA was compared with a commercial EIA for the detection of CNS in meat products (RIDASCREEN risk material test, R-Biopharm), which also uses bovine GFAP as a marker protein. In this test the mean recovery rates of bovine brain were 82 % in raw meat products and 29 % in heated meat products. The mean recovery of porcine brain was 103 %, while the mean recovery of ovine brain was twice as high as those of bovine brain. Brain of rabbits and horses was detected with recovery rates of one third of those of bovine brain.In order to check the applicability of the test for real food sample material as sold by retail shops 30 meat products were analysed and part of the extractions were artificially contaminated with ZNS-extracts. All samples were negativ for CNS. Artificially contaminated extracts yielded recoveries between 64 % and 121 %.Attemps to improve the species specifity of the antisera by purification with immunoaffinity chromatography were made. The chromatography was carried out with bovine and porcine GFAP which was coupled to Sepharose 4B. Neither the eluates whose were gained by using bovine-GFAP-Sepharose nor the antisera which had obtained by subtractive immunoaffinity chromatography using porcine-GFAP-Sepharose have resulted in an improvement of species specifity in the indirect or sandwich EIA.