Klonierung feliner Fibrosarkomzelllinien und deren zytogenetische Charakterisierung

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, etablierte Zelllinien von felinen Fibrosarkomen auf ihre Klonierbarkeit zu untersuchen und sie anschließend zytogenetisch zu charakterisieren. Anhand von zellbiologischen und immunzytologischen Methoden wurde das Auftreten numerischerChromosomen- und Zentrosomenaberrationen analysiert. Als gesunde Vergleichszelllinie dienten Hautfibroblasten eines jungen Katzenfetus, die in vitro eine schnelle Zellproliferation und ein gutes Zellwachstum zeigten. Die zytogenetische Charakterisierung dieser Zelllinien soll einen Beitrag zur Erkennung zytogenetischer Faktoren innerhalb der Pathogenese feliner Fibrosarkome leisten.2. Die Literaturübersicht erklärt genetische Instabilität unter besonderer Beachtung derAneuploidie und deren Bedeutung für die Tumorigenese maligner Tumoren. Im Weiteren werden Zentrosomenaberrationen, deren Vorkommen und Entstehungsmechanismen erläutert und gezeigt, dass numerische Zentrosomenaberrationen zu einer Chromosomenfehlverteilung mit konsekutiver genetischer Instabilität in Zellen führen können. Zudem wird der Stand der Forschung hinsichtlich chromosomaler Instabilität und Zentrosomenveränderungen bei malignen Tumoren von Menschen und Hunden dargestellt. Anschließend gibt der zweite Teil der Literaturübersicht einen Überblick über die verschiedenen Formen feliner Fibrosarkome und deren Kenntnis bezüglich Aneuploidie in Verbindung mit Zentrosomenaberrationen.3. Die eigenen Untersuchungen erfolgten an fünf klonal selektierten Fibrosarkomzelllinien und einer ebenfalls klonal etablierten Kontrollzellinie. Zur Analyse der Klonierbarkeit aller Zelllinien wurde die Limited-Dilution-Klonierung verwendet. Die zellbiologischen Untersuchungen zur Chromosomen-analyse erfolgte an Giemsa-gefärbten Metaphasenplatten. Die immunzytologische Untersuchung der Zentrosomen wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz mit einem monoklonalen Antikörper gegen g-Tubulin, dem Hauptprotein der Zentrosomen, durchgeführt.4. Bei allen Zelllinien konnten monoklonale Zellpopulationen etabliert werden. Es konnte gezeigt werden, dass alle Zelllinien eine starke Variation in ihrer chromosomalen Ausstattung aufwiesen. Die Chromosomenanalyse ergab Werte von 19 bis 155 Chromsomen pro Zelle. Sowohl zwischen den Zelllinien als auch innerhalb jeder Zelllinie zwischen verschiedenen Passagen traten signifikante Unterschiede hinsichtlich des Chromosomensatzes auf. Der Anteil von Zellen mit hyperamplifizierten Zentrosomen, d.h. mit mehr als erwartungsgemäß 1 oder 2 Zentrosomen/Zelle, lag zwischen 5,7 % und 15,2 %. Die Kontrollzelllinie wies nur 0,6 % Zellen mit mehr als 2 Zentrosomen auf. Bei allen Fibrosarkomzelllinien wurden in vitro numerische Zentrosomenaberrationen nachgewiesen. Vergleicht man die Fibrosarkomzellen mit den Kontrollzellen, so zeigt sich, dass 10- bis 25-mal so viele Zellen mehr als 2 Zentrosomen/Zelle aufwiesen.5. Die ermittelten Ergebnisse bestärken die Vermutung, dass numerische Zentrosomenaberrationen in einem Zusammenhang mit chromosomaler Instabilität stehen, indem sie eine fehlerhafte Chromosomensegregation während des Zellteilungszyklus bewirken. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einer weiteren Charakterisierbarkeit feliner Fibrosarkome bei. Sowohl die Ursachen als auch die Konsequenzen zentrosomaler Aberrationen bei felinen Fibrosarkomen bleiben ein interessantes Forschungsgebiet.

The purpose of this study was to get knowledge about the clonality of five already established feline fibrosarcoma cell lines and to characterize these cell lines cytogenetically. On the basis of biological and immunocytochemical methods, numerical chromosomal and centrosomal aberrations were examined. As a control, dermal fibroblasts were isolated from a fetal cat and cultured. These cells revealed in vitro a stable cell proliferation and cell growth. The cytogenetical characterization of these cell lines intends to make a contribution to the diagnosis of cytogenetical factors within the pathogenesis of feline fibrosarcomas.2. In the literature review, genetic instability considering aneuploidy was defined and its importance in the development of malignant tumors shown. Furthermore, centrosomal aberrations, their occurrence and development and their role in chromosome missegregation are explained with consecutive genetic instability. Moreover, the current state of knowledge regarding chromosomal instability and centrosomal alterations in malignant tumors in humans and in dogs is described. The second part of the literature reviews the classification of feline fibrosarcomas and the present knowledge of aneuploidy and centrosome hyperamplification in these tumors.3. Investigations were performed on five feline fibrosarcoma cell lines and dermal fibroblasts from a fetal cat as a control cell line. The clonality of all cell lines was examined using limited-dilution-cloning. The number of chromosomes were counted by metaphase spread. The prepared chromosomes were subjected to Giemsa staining and analyzed under a light microscope. The immunocytochemical analysis of centrosomes was performed by indirect immunofluorescence using anti-g-tubulin monoclonal antibody that targets g-tubulin, a major component of centrosomes.4. Monoclonal cell populations could be etablished from all cell lines. In all feline fibrosarcoma cell lines, the number of chromosomes was found to have abnormal deviation from the physiologic number 2n=38. The chromosomal analysis revealed 19 to 155 chromosomes/cell. Centrosomehyperamplification was observed in all five feline fibrosarcoma cell lines with a proportion of cells with more than 2 centrosomes/cell of 5.7 % to 15.2 %. The control cell line revealed only in 0.6 % of the cells more than 2 centrosomes/cell. Concluding, the feline fibrosarcoma cell lines revealed 10 to 25 times as many cells with centrosome hyperamplification as the control cell line.5. In conclusion, the study revealed that centrosome hyperamplification occurs in feline fibrosarcoma cell lines. These observations suggest an association of numerical centrosome aberrations with chromosomal instability by increasing the frequency of abnormal mitoses that lead to chromosome missegregation. The results of this study may be helpful for a further characterization of feline fibrosarcomas. Finally, the causes and as well the consequences of centrosome abnormalities in feline fibrosarcomas requires further investigations.