Funktionelle Untersuchung zur Wirtsfaktorabhängigkeit pestiviraler Replikation

Abstract

Das Genus Pestivirus bildet gemeinsam mit den Genera Flavi- und Hepacivirus die Familie der Flaviviridae. Vertreter des Genus Pestivirus sind das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV-1), das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe Typ 2 (BVDV-2), das Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) und das Border Disease Virus der Schafe (BDV). Pestiviren besitzen ein RNA-Genom von positiver Polarität, das etwa 12,3 Kilobasen (Kb) groß ist. Ein einziger offener Leserahmen (ORF), welcher im 5´- und 3´-Bereich von nichttranslatierten Regionen (NTRs) flankiert wird, kodiert für ein Polyprotein. Aufgrund der Fähigkeit in der Zellkultur nach Infektion einen zytopathischen Effekt auszulösen, werden zytopathogene (zp) und nichtzytopathogene (nzp) Biotypen unterschieden. Nur nzp BVDV Stämme können persistierende Infektionen hervorrufen. Die Viruspersistenz geht mit einer erworbenen Immuntoleranz gegen das infizierende Virus einher. Durch Rekombination oder Mutation im RNA-Genom des persistierenden Virus können zytopathogene (zp) Viren entstehen, welche die stets tödlich verlaufende Erkrankung Mucosal Disease (MD) im immuntoleranten Wirt auslösen. Eine Gemeinsamkeit der zp Stämme ist eine vermehrte Freisetzung des viralen Nichtstrukturproteins 3 (NS3) und eine damit verbundene verstärkte Synthese viraler RNA in infizierten Wirtszellen.Ein zelluläres Protein aus der Familie der J-Domänen-Chaperone hat wesentlichen Einfluss auf die Replikation von Pestiviren. Dieses Protein interagiert mit dem viralen Nichtstrukturprotein 2 (NS2) und wird daher als Jiv (kurz für: J-domain protein interacting with viral protein ) bezeichnet. Die Koexpression des Jiv-Proteins zusammen mit NS2-3 führt zur Spaltung von NS2-3 und damit zur Freisetzung von NS3. Einige zp BVDV Stämme tragen Jiv-kodierende Sequenzen in ihrem Genom, was eine unregulierte NS2-3-Prozessierung, eine hohe virale RNA-Replikationsrate und den zp Biotyp zur Folge hat.In der vorliegenden Arbeit konnte mithilfe eines auf Basis von Huh7 Zellen etablierten Assays erstmals gezeigt werden, dass das Jiv-Protein für die Replikation bestimmter nzp BVDV-1 Stämme essentiell ist. Darüberhinaus konnte mithilfe dieses Assays die Relevanz bestimmter Aminosäuren des Jiv-Proteins für dessen Unterstützung der viralen Replikation geklärt werden. Es wurden dabei zwei Regionen identifiziert, die für die Funktion des Jiv-Proteins im pestiviralen Lebenszyklus essentiell sind. Wird die Aminosäure Tryptophan an Position 39 zu Alanin (W39A) ausgetauscht, so unterbleibten die Aktivierung der viralen NS2 Protease und die NS2-3 Spaltung und damit die virale Replikation (NCP7-5A) in Huh7 Zellen. Ebenso führt eine Doppelmutation im NS2-Bindepeptid (Position 41 60 von Jiv90) an den Positionen 59 (Valin) und 60 (Tyrosin) zu einem Funktionsverlust von Jiv. Durch das Einfügen von Tetra-Alaninen hinter bestimmte Aminosäuren im Bereich des NS2-Bindepeptids wurde die Fähigkeit, die Replikation von nzp BVDV-1 NCP7-5A zu unterstützen ebenfalls stark beeinträchtigt. Dies spricht für eine besondere Bedeutung der Jiv-Region um das NS2-Bindepeptid. Jiv90 zeigte sich als das minimale Fragment, welches die nzp BVDV-1 NCP-5A Replikation noch unterstützen kann. Dies korreliert mit der Tatsache, dass Jiv90 die kleinste Jiv-Insertion im Genom von zp Pestiviren darstellt.Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit beschäftigte sich mit der molekularen Ursache für den niedrigen Jiv-Protein Gehalt in Huh7 Zellen. Die mittels Real-Time RT-PCR quantifizierte Menge der Jiv-mRNA war im Vergleich zu BVDV empfänglichen Wirtszellen um etwa 50% reduziert. Das von der Jiv-mRNA aus Huh7 Zellen kodierte Protein konnte die BVDV-Replikation unterstützen. Somit legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass die molekulare Basis für den Jiv-Mangel in Huh7 Zellen auf posttranskriptioneller Ebene liegt.Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur essentiellen Rolle des Wirtsfaktors Jiv für die Replikation bestimmter nzp Pestiviren stellen einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der molekularen Grundlage für die Viruspersistenz bei Pestiviren dar. The genus Pestivirus forms together with the genera Flavi- und Hepacivirus the familiy Flaviviridae. Members of the genus Pestivirus are the Bovine Viral Diarrhoea Virus type 1 (BVDV-1), Bovine Viral Diarrhoea Virus type 2 (BVDV-2), Classical Swine Fever Virus (CSFV) and Border Disease Virus of sheep (BDV). Pestiviruses have an RNA genome of positive polarity which is 12,3 kb in size. One open reading frame (ORF) which is flanked by untranslated regions (UTR) at the 5´- and 3´-end encodes one polyprotein.Based on the ability to cause a cytopathic effect in cell culture, cytopathogenic (cp) and noncytopathogenic (noncp) biotypes are distinguished. Only noncp BVDV strains are able to establish persistent infections. Viral persistence is associated with immunotolerance towards the persisting virus. Recombinations or mutations of the RNA genome of the persisting virus can emerge cytopathogenic (cp) viruses, which causes lethal Mucosal Disease (MD) in the immuntolerant host. One common feature of cp strains is increased release of nonstructural protein 3 (NS3) and thereby increased synthesis of viral RNA in infected host cells. A cellular protein of the J-domain-chaperone family has influence on the replication of pestiviruses. This protein interacts with the viral nonstructural protein 2 (NS2) and is termed Jiv (short for: J-domain protein interacting with viral protein ). Coexpression of Jiv together with NS2-3 leads to the cleavage of NS2-3 and release of NS3. Some cp BVDV strains comprise Jiv-coding sequences in their genome which results in unregulated NS2-3-processing, increased viral RNA-synthesis and determines the cp biotype.In the present work, a Huh7 cell assay was established which allows for the first time the demonstration, that the Jiv-protein is essential for certain noncp BVDV-1 strains. Furthermore the relevance of individual residues of Jiv for the support of viral replication could be investigated. Two regions have been identified which are essential for the function of Jiv in the viral life cycle. An exchange of amino acid tryptophan at position 39 to alanine (W39A) abolishes the activation of the NS2-protease and NS2-3 cleavage und therefore the viral replication (NCP7-5A) in Huh7 cells. Likewise, a double mutation within the binding peptide (Position 41 - 60) at positions 59 (valine) and 60 (tyrosine) leads to a loss of function of Jiv. The introduction of tetraalanines behind certain amino acids in the region of the NS2-binding peptide also affects the ability to support the replication of noncp BVDV-1 NCP7-5A. This shows significance for the NS2 binding peptide of Jiv. Jiv90 seems to be the minimal fragment which is able to support the replication of noncp BVDV-1 NCP-5A. This correlates with the fact that the minimal insertion of Jiv found within a cp genome is Jiv90. Another aim of this work was to find out the molecular basis for the low Jiv amount in Huh7 cells. The quantified amount of Jiv-mRNA in Huh7 cells, detected via real time RT-PCR, was about 50% reduced compared to BVDV susceptible host cells. The protein which is encoded by the Jiv-mRNA of Huh7 cells can support BVDV-replication. The results of this work indicate that the Jiv defiency of Huh7 cells is based on posttranscriptional level.The findings of this work about the essential role of the host factor Jiv for certain noncp pestiviruses contribute to the understanding of the molecular basis of pestiviral persistence.