Oxidative posttranslationale Redoxmodifikationen in Plasmodium falciparum

Abstract

Das die Infektionskrankheit Malaria auslösende Protozoon Plasmodium ist seit langem Mittelpunkt intensiver Forschung. Bisher sind seine Biologie, Biochemie und die Interaktion mit dem Wirt nicht vollständig verstanden. Die tödlichste Form der Erkrankung wird durch Plasmodium falciparum (P. falciparum) verursacht. Während seines komplexen Lebenszyklus ist der Parasit konstant oxidativem und nitrosativem Stress aus verschiedenen Quellen ausgesetzt. Somit ist eine adäquate Redoxkontrolle essentiell für das Überleben des Organismus. Hierzu gehört auch die Regulation von oxidativen posttranslationalen Modifikationen (oxPTM). Diese umfassen reversible und irreversible Modifikationen an den schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin. Ausgelöst werden oxPTM durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies. Cystein ist keine prominente Aminosäure im Proteom, aber aufgrund seiner Nukleophilität besonders zugänglich für oxPTM. OxPTM sind wichtig für die Regulation von Proteinen und dienen der Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. Zu den reversiblen oxPTM gehört unter anderem die Sulfenylierung. Diese instabile Modifikation dient als molekularer Schalter in der Regulation von Proteinen und generell im Redoxsignaling. Sulfenylierung ist auch oftmals ein Zwischenschritt zu stabileren Modifikationen wie S-Glutathionylierung. Ziel dieser Studie war es, das Sulfenylom im Trophozoiten-Stadium in P. falciparum 3D7 zu analysieren, mit Proteomdaten der oxPTM S Glutathionylierung und S-Nitrosierung zu vergleichen, und so stark redoxmodifizierte Proteine zu identifizieren. Die Analyse von im Vorfeld dieser Arbeit erhobenen Massenspektrometriedaten ergab eine Trefferliste von 102 sulfenylierten Proteinen mit insgesamt 152 modifizierten Cysteinen. Der Abgleich dieser Trefferliste mit den 491 identifizierten glutathionlyierten und 317 nitrosierten Proteinen zeigt, dass ca. 11 % des Proteoms von P. falciparum redoxmodifizierbar scheint. Hiervon lassen sich 38 % mit mehr als einer Redoxmodifikation nachweisen. Insgesamt konnte ca. 1 % des gesamten Proteoms mit allen drei Redoxmodifikationen identifiziert werden. Besonders stark redoxmodifiziert sind die glykolytischen Proteine. Obwohl diese nur 0,001 % des Proteoms von P. falciparum ausmachen, stellen sie 7 % des identifizierten Sulfenyloms dar. Gleichzeitig werden fast alle glykolytischen Proteine ebenfalls nitrosiert und glutathionyliert. Für einige Proteine konnte bereits eine Regulation der Aktivität durch oxPTM nachgewiesen werden. Dies unterstreicht die wichtige Funktion von Redoxmodifikationen als Regulationsmechanismus in einem Proteom. Eines der stark redoxmodifizierten Proteine ist der macrophage migration inhibitory factor (MIF). Das Plasmodium Homolog zum humanen MIF (hMIF) fungiert als Virulenzfaktor und ist in der Lage das menschliche Immunsystem zu modulieren, um das Überleben des Parasiten zu verbessern. Zusätzlich verfügt das Protein über eine Oxidoreduktase- und Tautomeraseaktivität. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die vier Cysteine von PfMIF hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit gegenüber Redoxmodifikationen und ihrer Relevanz für die Enzymaktivität analysiert. Dazu wurden Cystein-zu-Alanin Mutanten generiert und parallel zu dem Wildtypprotein und hMIF charakterisiert. Proteine wurden nitrosiert und glutathionyliert und anschließend mittels Protein Immunoblot und Massenspektrometrie untersucht. Zusätzlich wurden die Proteine auf ihre Aktivität im Tautomeraseassay und in Rezeptorinteraktionsstudien mit den humanen Rezeptoren CXCR2 und 4 analysiert. Zur Untersuchung einer eventuellen Konformationsänderung durch Redoxmodifikationen wurden modifizierte Proteine kristallisiert. Es konnte eine S-Nitrosierung und S-Glutathionylierung für PfMIF und hMIF nachgewiesen werden, welche allerdings keinen sichtbaren Einfluss auf die Tautomeraseaktivität der Proteine hatte. PfMIFC3A, PfMIFC3AC4A und PfMIFC103A hingegen zeigten eine signifikant verringerte Tautomeraseaktivität. Erstmals konnte eine Interaktion zwischen PfMIF und den humanen Rezeptoren CXCR2 und 4 nachgewiesen werden. Die Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden durch Rezeptorbindung wurde signifikant durch S-Nitrosierung und S-Glutathionylierung von PfMIF verringert. Somit konnte ein direkter Einfluss von Redoxmodifikationen auf die biologische Funktion des Proteins gezeigt werden. PfMIFC3A, PfMIFC4A und PfMIFC59A zeigten ebenfalls eine signifikant verringerte Aktivierung der Rezeptoren. Inwiefern dies auf eine Konformationsänderung des Proteins zurückgeht, wurde anhand von Kristallisationsanalysen untersucht. Eine Kristallstruktur von nitrosiertem PfMIF konnte bei einer Auflösung von 1,7 Å erhalten werden. Mit dieser Studie konnten Erkenntnisse aus vorangegangenen Studien vom Glutathionylom und Nitrosom um das Sulfenylom ergänzt werden. Dies erlaubt weitreichende Einblicke in die Redoxmodifikationen von Proteinen des Malariaerregers Plasmodium falciparum und bietet neue Angriffspunkte für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren.