Spezies-spezifischer Nachweis von Chlamydien bei Haustieren mittels Real-Time PCR

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von sensitiven undzuverlässigen Real-Time PCR-Assays zum Nachweis von Chlamydophila(Cp.) psittaci, Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae und Chlamydia(C.) suis. Dabei wurden DNA-Sequenzen der ompA- und 23S-rRNA-Gene für dendifferenzierten Erregernachweis herangezogen. Zur Identifizierung der Chlamydien-Spezies wurde mit Ausnahme von Cp. psittaci jeweils eine klassische TaqManÒ-Sonde entworfen. Aufgrund der großen Nukleotidsequenz-Homologie zwischenCp. psittaci und Cp. abortus wurden zur Identifizierung von Cp. psittaci zweiTaqManÒMGB-Sonden verwendet. Im Rahmen der Etablierung der Methodenwurden Tests zur Reproduzierbarkeit, Spezifität und Nachweisgrenze durchgeführt.Für alle entwickelten Real-Time PCR-Assays wurde eine Nachweisgrenze zwischen8 bis 80 Chlamydienpartikel und 4 bis 40 Einschlusskörperchen-bildenden Einheiten(EBE) pro Reaktionsansatz ermittelt. Alle verwendeten Assays erwiesen sich alsreproduzierbar, spezifisch und sensitiv.Um die tierartliche Häufigkeitsverteilung der verschiedenen tierpathogenenChlamydien-Spezies (Cp. psittaci, Cp. abortus, Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviaeund C. suis) zu analysieren, wurden DNA-Proben von Psittaziden, Tauben undverschiedenen Säugetierarten, die bereits positiv auf Chlamydiaceae-DNA getestetworden waren, mit den Spezies-spezifischen Real-Time PCR-Assaysnachuntersucht. Auffallend ist, dass bei Psittaziden und Tauben nicht nur Cp. psittaci(92 %), sondern auch Cp. abortus (8 %) relativ häufig vorkam. Während beiSchweinen, Rindern, Schafen und Pferden DNA der Spezies Cp. psittaci,Cp. abortus, Cp. pecorum oder C. suis einzeln oder in Kombination festgestelltwerden konnten, wurde bei Katzen mit Cp. felis (135/138; 98 %) sowie beiMeerschweinchen und Kaninchen mit Cp. caviae (12/12 bzw. 4/4; 100 %)überwiegend die DNA nur einer einzigen Erregerspezies nachgewiesen. DNA dieserbeiden Chlamydophila-Spezies war auch in den Proben von Hunden (Cp. felis 4/5;80 % und Cp. caviae 1/5; 20 %) zu finden.Beim Vergleich der mit den Real-Time PCR-Assays und der Microarray-Technikerzielten Ergebnisse ließ sich bei 4 der 15 untersuchten Proben eine vollständigeÜbereinstimmung bei der Speziesidentifizierung von Chlamydien feststellen. In derProbe einer Katze wurde mit Hilfe der Microarray-Technik zusätzlich DNA vonC. trachomatis nachgewiesen, für die in dieser Arbeit kein entsprechender Real-TimePCR-Assay entwickelt worden war. Die 11 unterschiedlich bewerteten Probenenthielten DNA von wenigstens zwei Chlamydienarten, wobei die Microarray-Technikstets nur diejenige Spezies erkannte, die im Real-Time PCR-Assay den niedrigerenCT-Wert erzielte, d.h. das stärkere Signal erzeugte.Im Rahmen eines Ringversuches, an dem 16 deutsche Untersuchungseinrichtungenin Deutschland teilnahmen, wurden zwei Real-Time-PCR-Assays zum Nachweis vonChlamydiaceae- bzw. Cp. psittaci-DNA (Assays 1 und 12) auf ihre Eignung für dieveterinärmedizinische Psittakose-/Ornithose-Diagnostik geprüft. Dazu wurdeninsgesamt 25 Proben sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle an dieTeilnehmer verschickt und von diesen nach standardisierten Arbeitsprotokollenuntersucht. Beide Assays erwiesen sich als sensitiv und spezifisch und ergaben eineNachweisgrenze von 100 EBE je Probe.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass alle gegenwärtig in derVeterinärmedizin relevanten Chlamydien-Spezies mit Hilfe von Real-Time PCRAssayssensitiv und Spezies-spezifisch in entsprechend aufgearbeitetem Probenmaterialnachzuweisen sind. Alle untersuchten Chlamydien-Spezies kommen beiTieren in Deutschland vor. Dabei sind sie nicht auf eine einzelne Wirtsspeziesbeschränkt, sondern von ihren Hauptwirten offenbar auch auf Individuen andererArten übertragbar. Die Befunde deuten ferner daraufhin, dass Mischinfektionen durchzwei Chlamydien-Spezies nicht selten sind. Die Anwendung von Real-Time PCRAssaysin der Routinediagnostik kann insbesondere der in der Psittakose-VObegründeten Forderung nach dem spezifischen Nachweis von Cp. psittaci gerechtwerden. The objective of the present study was to develop and establish sensitive and reliablereal-time PCR assays for the detection of Chlamydophila (Cp.) psittaci Cp. abortus,Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae and C. suis. For this purpose DNA sequences ofompA- and 23S-rRNA-genes served as targets. Species-specific assays based onclassical TaqManÒ probes were designed for the identification of all these chlamydialspecies except Cp. psittaci. For unambiguous identification of Cp. psittaci it wasnecessary to design two minor groove-binding (MGB) probes in order to cope withthe high homology between the target sequences of Cp. psittaci and Cp. abortus.Establishment of real-time PCR assays included tests for determination ofreproducibility, specificity and the detection limits. In these tests assays were able todetect DNA equivalent to 8 - 80 chlamydial particles or 4 - 40 Inclusion Forming Units(IFUs), respectively. All assays proved to be reproducible, specific and sensitive.To analyze the occurrence of chlamydial species (Cp. psittaci, Cp. abortus,Cp. pecorum, Cp. felis, Cp. caviae and C. suis) DNA samples from psittacine birdsand pigeons, as well as several mammalian species that had been previously testedpositive in a Chlamydiaceae-specific real-time PCR, were retested with the newlydeveloped species-specific real-time PCR assays. Surprisingly, DNA not only ofCp. psittaci (92 %), but also of Cp. abortus (8 %) was found in samples frompsittacine birds and pigeons rather frequently. DNA of Cp. psittaci, Cp. abortus,Cp. pecorum or C. suis, singly or two species in one sample, was detected in pigs,cattle, sheep and horses. Cp. felis was the predominant species in samples from cats(135/138; 98 %), whereas in guinea pigs and rabbits only Cp. caviae was detected(12/12 and 4/4; 100 %). Interestingly, both pathogens were also identified in samplesfrom dogs (Cp. felis 4/5; 80 % and Cp. caviae 1/5; 20 %).Fifteen samples were comparatively tested for chlamydial DNA by the newlydeveloped real-time PCR assays and an established microarray assay. Four samplesyielded the same results in both assays. In one sample from a cat C. trachomatiswas detected additionally, a species not considered in the process of PCR assaydevelopment. Samples yielding different results in both assays contained DNA of atleast two chlamydial species. In each of these eleven samples the microarray assaydetected only one species and in particular that species that gave the strongestsignal in the real-time PCR assays.A ring trial among 16 german laboratories was performed in order to test thesuitability of two real-time PCR assays (assays 1 and 12) for the detection ofChlamydiaceae- and Cp. psittaci-DNA, respectively, in veterinarypsittacosis/ornithosis diagnostics. For this purpose a panel of 25 samples as well asa positive and negative controls were shipped and tested by the participantsaccording to a standard PCR protocol. Both assays approved to be specific andsensitiv and revealed a detection limit of 100 IFU per sample.Results of this study demonstrate that all chlamydial species currently relevant inveterinary medicine can be detected sensitively and species-specifically in processedclinical samples by means of real-time PCR assay. All chlamydial species that werelooked for in this study were detected among animals in Germany. Since none ofthese species was restricted to a single host species transmission of thesepathogens from their major hosts to individuals of other species appears as acommon phenomenon. Moreover, results suggest that mixed infections by twochlamydial species occurs frequently. The application of real-time PCR assay inroutine diagnostics meets the requirements of German psittacosis regulation claimingfor species-specific detection of Cp. psittaci.