Konstruktion eines Contigs aus künstlichen Hefechromosomen in der Region q31.3-q33.1 des menschlichen Chromosoms 5

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines YAC-Contigs in der Region 5q31/32-q33. Dieser Region waren zahlreiche Gene für Wachstumsfaktoren,Wachstumsfaktorrezeptoren, Hormonrezeptoren und Neurotransmitterrezeptoren zugeordnet worden. Zugeordnet hatte man diesem Chromosomenabschnittauch mehrere Gene, die verantwortlich sind für eine Reihe verschiedenster Erkrankungen, u.a. dem Treacher Collins Syndrom. Diese Gene waren zu Beginndieser Arbeit jedoch noch nicht isoliert. 5q31/32-q33 gilt im weiteren als kritische Region für das 5q-Syndrom, einer hämatologischen Erkrankung. In der Region 5q31/32-q33 lokalisierte YACs wurden durch Screening der ICRF- sowie der CEPH-YAC-Bibliothek isoliert. Durchgeführt wurde dasScreening mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR), basierend auf der sogenannten two step pooling-method. Insgesamt konnten so 44 YACs isoliert werden (vier dieser 44 YACs wurden im Laufe dieser Arbeit durch Li et al. bereits in einem Contig integriert undveröffentlicht). Zusätzlich standen YACs der ICI-Bank für den Aufbau des Contigs zur Verfügung. Diese waren durch die Arbeitsgruppe von Dr. M. Dixonbereits der Region 5q31-qter zugeordnet worden. 9 ICI-YACs konnten integriert werden. Aus allen YAC-Klonen wurde DNA isoliert. Die Größe der einzelnen YACs wurde durch Pulsed-Field-Gelektrophorese (PFGE) bestimmt. Hierzu wurden zunächst die Elektrophoresebedingungenoptimiert. Im Anschluß an die Auftrennung der Hefe-Chromosomen durch PFGE erfolgte ein Southern-Blotting sowie eine Hybridisierung gegengesamtmenschliche DNA. Dies diente der Abgrenzung und Identifikation der YAC-Klone gegenüber den 'natürlichen' Hefe-Chromosomen. Das 'kleinste'YAC war ca. 200 kb groß, das 'größte' etwa 1600 kb. Das Contig wurde konstruiert, indem man mit Hilfe der PCR nach Überlappungen zwischen verschiedenen YAC-Klonen suchte: YACs, die sich überlappen,zeigten in der PCR mit demselben Marker ein positives Ergebnis. Mittels inverser PCR wurden YAC-Endfragmente isoliert. In Plasmiden kloniert und im Anschluß sequenziert, konnten insgesamt drei echte Endfragmenteidentifiziert werden. Die daraus generierten neuen STS-Marker konnten beim chromosome walking eingesetzt werden. Ein vollständig überlappendes Contig konnte nicht konstruiert werden. Es wurden jedoch 3 Teilcontigs aus insgesamt 54 YACs erstellt. 41 Marker wurden indiese Karte integriert, darunter 11 Gene. Insgesamt konnten 9 neu generierte Marker zugeordnet werden. Das Contig umfaßt wahrscheinlich mehr als 8 Mb.