Expression, Lokalisation und funktionelle Aspekte des Peptidtransporters PEPT2 in den Atemwegen von Ratte, Maus und Mensch

Abstract

Fragestellung und Methodik Peptide sind wichtige Mediatoren physiologischer und pathophysiologischer Prozesse in der Lunge. Ihre biologische Aktivität wird durchpulmonale Peptidasen terminiert. Da der enzymatische Abbau von Proteinen und mikrobiellen Bestandteilen über einen Anstieg desosmotischen Gradienten zu einem erschwerten Gasaustausch führen kann, besitzt der Abtransport von Peptidfragmenten für dieAminosäurebilanz der Lunge eine zentrale Bedeutung. Neben der Bedeutung als gasaustauschendes Organ spielt das respiratorischenEpithel eine wichtige Rolle als Grenzbarriere zwischen dem Organismus und seiner Umwelt. Die große Oberfläche von 70 bis 140 m2 kanndabei effizient zur Administration verschiedener Pharmaka benutzt werden. In dieser Hinsicht konnte bereits eine Vielzahl vonTransporterproteinen im respiratorischen Epithel funktionell charakterisiert werden. Die cDNAs zweier Familien Protonen-gekoppelter Oligopeptidtransporter wurden in den vergangenen Jahren aus Epithelzellen von Darm(PEPT1) und Niere (PEPT2) kloniert. Während die Expression von PEPT1-mRNA ausschließlich in Darm und Niere festgestellt wurde,konnte man PEPT2-mRNA in der Niere sowie in einer Reihe weiterer Organen wie dem ZNS und der Lunge nachweisen. Beide Isoformen besitzen 12 transmembranäre Domänen und teilen eine ca. 47 %ige Identität auf der Proteinebene. Die Transporterkatalysieren eine zelleinwärts gerichtete Substrattranslokation, die an einen elektrochemischen Protongradienten gekoppelt ist. Neben desTransports endo- und exogener Di- und Tripeptide transportieren PEPT1 und PEPT2 Peptidpharmaka wie z. B. Cephalosporine,Aminopenizilline, Angiotensin-Converting-Enzyme-Inhibitoren sowie Antimetabolite wie Valaciclovir und das Zytostatikum Bestatin. Die Fähigkeit PEPT2s zum Transport von Antibiotika rückt den Transporters in das Blickfeld therapeutischer Überlegungen bei deraerosolischen Antibiotikatherapie rekurrenter Atemwegsinfektionen. In dieser Arbeit wurde die Expression von PEPT2 in Lungengeweben von Ratte, Maus und Mensch untersucht. Auf transkriptioneller Ebenewurden RT-PCR und Northern-Blotting an Rattengeweben zum Nachweis der PEPT2-mRNA durchgeführt. Zur exakten Lokalisation derRatten PEPT2-mRNA auf zellulärer Ebene diente die Methode der nonradioaktiven In-situ-Hybridisierung. Immunhistochemische Studienermöglichten eine Darstellung PEPT2s in Lungengeweben von Ratte und Maus auf der translationalen Ebene. Es wurde zusätzlich ein Modell zur Ex-vivo-Aufnahme von Oligopeptiden in murinen Lungenpräparaten entwickelt, um den Peptidtransportauch funktionell nachzuweisen. Eine Kombination der Aufnahmestudien mit der Lektinhistochemie diente zum Ausschluss einesTransportvorganges in Typ I-Pneumozyten. Darüber hinaus wurden immunhistochemische und funktionelle Ex-vivo-Studien an Geweben von normalen humanen Lungen sowieMukoviszidose-Lungenresektaten vorgenommen. Ergebnisse Durch RT-PCR konnte PEPT2-mRNA in Lungen- und Nierenextrakten der Ratte nachgewiesen werden. Dieser Befund korreliert mit Datender Kaninchenlunge. PEPT2-mRNA wurde in der Rattenlunge zusätzlich durch das Northern-Blot Verfahren nachgewiesen. Um die exakte mRNA-Lokalisation auf zellulärer Ebene zu bestimmen, wurden non-radioaktive In-situ-Hybridisierungen durchgeführt undeine Expression von PEPT2-mRNA in Typ II-Pneumozyten, Bronchialepithelzellen und Endothelzellen kleinerer Bronchus-venolen derRattenlunge nachgewiesen. Immunhistochemische Studien konnten PEPT2-Immunreaktiviät in Bronchialepithelzellen, Typ II-Pneumozyten und Endothelzellen vonRatten- und Mäuselungen identifizieren. Funktionelle Ex-vivo-Aufnahmestudien mit dem fluoreszierenden Dipeptidderivat (D)-Alanin-(L)-Lysin-AMCA an isolierten Mäusethoracesführten zu einer Aufnahme in das Bronchialepithel und Typ II-Pneumozyten. Die zytoplasmatische Akkumulation des fluoreszierendenSubstrats wurde im Verdrängungsexperiment durch das Dipeptid Glycil-Glutamin und das Cephalosporin Cefadroxil fast vollständiginhibiert. Über kombinierte Ex-vivo-Aufnahme- und histochemische Studien mit LEA konnte ein Transport des Dipeptidkonjugats in TypI-Pneumozyten ausgeschlossen werden. Immunhistochemische Versuche an Geweben von normalen humanen Lungen konnten eine PEPT2-spezifische Immunreaktivität ebenfallsin Bronchialepithelzellen, Typ II-Pneumozyten und Endothelzellen von Bronchialvenolen nachweisen. Studien an Lungenresektaten vonlungentransplantierten Mukoviszidosepatienten führten zu dem gleichen Immunreaktivitätsmuster, so dass eine qualitative Differenz imMuster der PEPT2 Immunreaktivität zwischen normaler Lunge sowie pathologisch verändertem Muko-viszidosegewebe ausgeschlossenwerden konnte. Zusätzlich wurden die Ex-vivo-Aufnahmestudien vom Tiermodell auf humane Gewebe übertragen. Mit dem Transport von(D)-Alanin-(L)-Lysin-AMCA in das respiratorische Flimmerepithel und in Typ II-Pneumozyten stellte sich im normalen und imMukoviszidosegewebe ein identisches Aufnahmemuster dar. Quantitativ wurde die Aufnahme des Dipeptidderivats inMukosviszidosegeweben jedoch durch den starken Sekretverhalt gemindert. Schlussfolgerung Es konnten erstmals die Expression, Lokalisation und funktionelle Aspekte eines definierten Oligopeptidtransportsystems im Atemtraktnachgewiesen werden und somit eine molekularbiologische und morphologische Grundlage zu früheren Hypothesen über einenOligopeptidtransport in der Lunge geschaffen werden. Die Expression des Transporters in Tracheal- sowie Bronchialepithelzellen, Typ II-Pneumozyten und Endothelzellen submuköser Venen,sowie die Fähigkeit PEPT2s, Betalaktamantibiotika wie beispielsweise Cefadroxil, ein gegen Gram-negative und Gram-positive Erregerwirksames Cephalosporin zu transportieren, rückt den Transporter in das Blickfeld therapeutischer Überlegungen bezüglich deraerosolischen Antibiotikatherapie rekurrenter Atemwegsinfektionen.