Der Einfluß von Calpain auf die Reperfusionsphase nach koronarer Ischämie am Modell des isoliert perfundierten Kaninchenherzens

Abstract

In der vorliegenden Studie wurde am Modell des isoliert perfundierten Kaninchenherzens nach Langendorff der Einfluss einer Calpainaktivierung auf die Reperfusionsphase nach koronarer Ischämie untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mit dem Capaininhibitor CAL425 behandelte Kaninchenherzen mit unbehandelten Herzen unter normothermer Globalischämie und Zugabe von Lipopolysacchariden zum Perfusat mit dem Ziel einer zusätzlich verstärkten Calpainaktivierung etwa im Rahmen einer Sepsis untersucht. Als Messparameter dienten hierbei die linksventrikuläre auxotonische Kontraktionsamplitude, der koronare Gefäßwiderstand und die Koronarperfusion, sowie die Freisetzung der Metaboliten Kreatinphosphokinase und Lactat-Dehydrogenase. Es wurde nachgewiesen, dass nach Applikation von LPS durch Verwendung des Calpaininhibitors CAL425 eine signifikante Besserung der untersuchten funktionellen Leistungsparameter erreicht werden konnte (s. 4.1). Es wurde in der mit CAL425 behandelten Gruppe ein signifikant niedrigerer koronarer Gesamtwiderstand (5,24 ± 0,77 mmHgmingml-1) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (7,36 ± 0,79 mmHgmingml-1) gegen Ende der Reperfusionsphase beobachtet. Ausserdem zeigte sich ebenfalls am Ende der Reper- fusionsphase in der Inhibitorgruppe eine signifikant bessere linksventrikuläre Kontraktionsamplitude (19 ± 5,9 mmHg) im Gegensatz zur unbehandelten Gruppe (9,7 ± 2,2 mmHg). Daher kann geschlussfolgert werden, dass der hochspezifische und hochpotente Calpain-Inhibitor CAL425 einen protektiven Effekt auf das Myokard im Modell des isoliert perfundierten Kaninchenherzens bei Endotoxämie im Rahmen eines septischen Schocks hat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur Quantifizierung der Calpainaktivität am Modell des isoliert perfundierten Kaninchenherzen mittels des zellgängigen, calpainspezifischen Substrates SLLVY-AMC (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amino-4-Methylcoumarin) entwickelt. Bei den mit dem Calpain-Inhibitor I (N-Acetyl-Leu-Leu-norleucinal, Fa. Roche) behandelten Kaninchenherzen konnte direkt nach Durchführung einer normothermen Globalischämie eine verringerte Calpainaktivität, gemessen an der Ausscheidung des Spaltproduktes AMC (Amino-4-Methylcoumarin), im Vergleich zur unbehandelten Gruppe beobachtet werden. Desweiteren konnte in in vitro Versuchen durch Differenzierung anderer, an der Spaltung des calpainspezifischen Substrates beteiligter Proteasen der Einfluß des Multikomplexenzyms Proteasom näher untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass Proteasom an der Spaltung von SLLVY-AMC massgeblich beteiligt ist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Calpain-Inhibitor I nicht nur an der Hemmung der Substratspaltung durch Calpain, sondern auch an der Inhibition der Substratspaltung durch das Proteasom beteiligt sein muss. Diese Interaktion des Calpain-Inhibitor I und dem ubiquitären, intrazellulären, nicht lysosomalen Multikomplexenzym Proteasom zeigt, dass der Calpain-Inhibitor I in hohem Masse auch an der Inhibition anderer intrazellulärer Enzymsysteme beteiligt ist und daher kein selektiver Calpaininhibitor ist. Daher ist seine Verwendung bei in vivo Studien zur selektiven Calpaininhibition fragwürdig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die beobachteten protektiven Effekte bei Ischämie und inflammatorischen Reaktionen durch Calpaininhibition von grosser klinischer Relevanz sein könnten. Daher erscheint eine weitere Erforschung mit geeigneteren pharmakologischen Substanzen, wie etwa eines fluorogenen Designersubstrates für Calpain sinnvoll. Ausserdem erscheint eine genauere Differenzierung des Einflusses des Calpain-Inhibitor-I auf den Proteasommetabolismus wichtig. Besonders relevant für die Klinik erscheint die weitere Testung des Calpaininhibitors CAL425 zur Reduktion des Ischämie/Reperfusionsschadens sowohl am Herzen, als auch an anderen Organsystemen aufgrund seiner hohen Spezifität und Potenz für Calpain.