Strukturelle und funktionelle Genomanalysen an Listeria monocytogenes EGD-e
| dc.contributor.author | Both, H. Ulrich von | |
| dc.date.accessioned | 2023-03-16T19:59:17Z | |
| dc.date.available | 2004-02-05T13:59:54Z | |
| dc.date.available | 2023-03-16T19:59:17Z | |
| dc.date.issued | 2003 | |
| dc.identifier.uri | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-13910 | |
| dc.identifier.uri | https://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/13375 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-12757 | |
| dc.description.abstract | Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes stellt v.a. für immunsupprimierte Personen und Feten einen gefährlichen Erreger dar. Die Listeriose ist besonders aufgrund ihrer relativ unspezifischen Klinik sowie der Fähigkeit des Keimes, sich anspruchslos in Lebensmitteln zu vermehren, eine ernstzunehmende Erkrankung mit zahlreichen Manifestationsformen. Darüber hinaus kann der Erreger verschiedene Gewebe bzw. Gewebsschranken innerhalb des Körpers überwinden. So stellen zum Beispiel weder die Blut-Hirn-Schranke noch die Plazentaschranke eine unüberwindbare Barriere für Listeria monocytogenes dar, was die verschiedenen Krankheitsbilder einer Infektion mit diesem Bakterium erklärt. Listeria monocytogenes hat sich als ein hilfreicher Modellorganismus zur Erforschung von Invasionsstrategien und Virulenzeigenschaften intrazellulärer Krankheitserreger erwiesen. Erstes Ergebnis dieser Arbeit war die Bestimmung der Genomgröße und die Erstellung einer chromosomalen Karte von L. monocytogenes EGD Serotyp 1/2a. Alle bislang bekannten Virulenzgene konnten darüber hinaus exakt auf dem 3000± 50 kb großen Genom kartiert werden. Ein Vergleich dieser Karte mit bereits vorhandenen Genomkarten der verwandten Listerien Stämme LO28 und Scott A unterstrich die Vermutung, dass verwandte Serotypen (EGD Serotyp 1/2a: LO28 Serotyp 1/2c) auch in Bezug auf ihre Genomstruktur und die Anordnung von Virulenzgenen deutliche Übereinstimmungen aufweisen und sich damit von anderen Serotypen (Scott A: Serotyp 4b) unterscheiden. Die in dieser Arbeit angewandte Strategie zur Erstellung einer physikalischen und genetischen Karte stellt durch die Kombination von Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und molekularer Genetik eine elegante Alternative zu den bisher verwendeten Verfahren dar. Das BAC-System (bacterial artificial chromosome) wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit zur Erstellung mehrerer BAC-Genbanken von L. monocytogenes EGD eingesetzt und um einen neu entwickelten shuttle-BAC-Vektor, pUvBBAC, erweitert. Eine der erstellten Genbanken fand im Anschluss an diese Arbeit im Rahmen des europäischen L. monocytogenes EGD Genomprojekts Verwendung. Das BAC-System erlaubt es, große (< 300 kb) funktionelle Genabschnitte zu klonieren und die jeweiligen Genprodukte im E. coli Wirt zu exprimieren. Der neue Vektor pUvBBAC erweitert das ursprüngliche Spektrum der BAC-Vektoren um den Gram positiven Bereich und eröffnet somit die Möglichkeit für Komplementationsexperimente mit verwandten Listeria Stämmen. In dieser Arbeit ist es gelungen, das Virulenzgenkluster (vgc) von L. monocytogenes EGD, vor dem Hintergrund der vorherigen Kartierung, auf einem großen (< 100 kb) funktionellen DNA Fragment mit Hilfe des Vektors pUvBBAC zu klonieren. Die anschließende Komplementation des verwandten, apathogenen Stammes Listeria innocua. mit den neuen Konstrukten (pUvBBAC+vgc1: 96,6 kb; pUvBBAC+vgc2: 84,5 kb) führte in vitro nachweislich zu einem Transfer virulenter Eigenschaften. So konnte unter anderem eine deutliche hämolytische Aktivität der mit den vgc-Konstrukten komplementierten L. innocua Stämme im Vergleich zum apathogenen Wildtyp aufgezeigt werden. Die in vivo Auswirkungen dieses Virulenztransfers müssen mit Hilfe von Infektionsmodellen (Zellkultur, Maus) weiter abgeklärt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen die Bedeutung der PFGE-Kartierung im Zusammenhang mit epidemiologischen Untersuchungen und Genomanalysen, und eröffnen durch die Erweiterung der BAC-Systems und den Einsatz des neuen Vektors pUvBBAC neue Ausblicke auf dem Feld der funktionellen Genomik. | de_DE |
| dc.description.abstract | Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogen responsible for both invasive and non-invasive food-borne illness in animals and humans. In this study, macrorestriction analysis following pulsed-field gel electrophoresis was used to show that Listeria monocytogenes serovar 1/2a strain EGD-e has a single chromosome containing eight NotI fragments of 1100, 850, 365, 320, 275, 40, 30 and 20 kb in size and 11 AscI fragments of 860, 470, 410, 360, 320, 250, 110, 80, 50, 30 and 20 kb. The total genome therefore comprises 3000±50 kb. The creation of a physical and genetic map of the Listeria genome was achieved by generating NotI linking clones and their use in subsequent hybridization analysis. Using isogenic mutants harboring additional artificial NotI restriction sites, the positions of all currently known virulence genes could be precisely mapped on the chromosome. Bacterial artificial chromosome (BAC) libraries are important tools for microbial genome research. The vector pBeloBAC11 was used for the construction of two BAC libraries of the Listeria monocytogenes EGD-e chromosome. These BAC libraries harbored inserts of 25-50 kb and 60-140 kb, respectively. Besides a beneficial use of these BACs for functional genomic analyses, the libraries supported the European Listeria Genome project. A novel BAC vector pUvBBAC was constructed for replication in both Gram-negative and Gram-positive bacterial hosts. The pUvBBAC vector was used to generate a BAC library for Listeria monocytogenes EGD-e with inserts of up to 80-160 kb in size. Two recombinant BAC plasmids, pUvBBAC+vgc1 (insert: 96,9 kb) and pUvBBAC+vgc2 (insert: 84,5 kb), from this pUvBBAC library were identified haboring the virulence gene cluster (vgc) of L. monocytogenes EGD-e and thus marking the first successful cloning of the entire vgc on a functional chromosomal fragment. The vgc-constructs were transfered to a non-pathogenic Listeria innocua strain. This transfer conferred to the recombinant L. innocua strains the ability to express listeriolysin and the actin-nucleating factor, actA, two virulence genes from Listeria monocytogenes EGD-e. Furthermore, the strains showed a significant haemolytic activity on blood agar plates demonstrating a successful virulence transfer using the novel vector pUvBBAC. The construction and use of the first BAC vector capable of stable propagation in both Gram-positive and Gram-negative hosts increases the genetic tools available for the study of a broad range of bacteria. Functional genomic analysis of large chromosomal fragments can now be performed for a large group of bacteria that are important pathogens (Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus), in industrial use (Bacillus spp., Lactobacillus) or even for unculturable bacterial species in the environment which maybe accessed by BAC cloning. In the presented work, studies with this vector have led to the first successful cloning of the listerial vgc pathogenicity island and its functional expression in a non-pathogenic strain. Futher manipulation of the Listeria innocua recombinant strains generated in this work could also lead to novel strains dosed with virulence and survival genes appropriate for vaccine development. | en |
| dc.language.iso | de_DE | de_DE |
| dc.rights | In Copyright | * |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | * |
| dc.subject | Listeria monocytogenes EGD | de_DE |
| dc.subject | funktionelle Genomik | de_DE |
| dc.subject | BAC (bacterial artificial chromosome) | de_DE |
| dc.subject | pUvBBAC | de_DE |
| dc.subject | Virulenztransfer | de_DE |
| dc.subject | Listeria monocytogenes EGD | en |
| dc.subject | physical and genetic map | en |
| dc.subject | BAC (bacterial artificial chromosome) | en |
| dc.subject | functional genomics | en |
| dc.subject | virulence transfer | en |
| dc.subject.ddc | ddc:570 | de_DE |
| dc.title | Strukturelle und funktionelle Genomanalysen an Listeria monocytogenes EGD-e | de_DE |
| dc.title.alternative | Structural and functional genomic analyses on Listeria monocytogenes EGD-e | en |
| dc.type | doctoralThesis | de_DE |
| dcterms.dateAccepted | 2003-11-28 | |
| local.affiliation | FB 11 - Medizin | de_DE |
| thesis.level | thesis.doctoral | de_DE |
| local.opus.id | 1391 | |
| local.opus.institute | Zentrum für Medizinische Mikrobiologie und Virologie, Institut für Medizinische Mikrobiologie | de_DE |
| local.opus.fachgebiet | Medizin fachübergreifend | de_DE |
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