Herstellung, Charakterisierung und Einsatz von monoklonalen Antikörpern gegen ein synthetisches ZP2-Peptid

Abstract

Das Zona pellucida 2 (ZP2) Protein ist im Maussystem für die feste, sekundäre Bindung des Spermatozoons an die Zona pellucida der Eizelle von Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Antikörper (mAk) gegen ein synthetisches ZP2 Peptid hergestellt. Dieser Antikörper wurde eingesetzt, um das ZP2-Protein immunbiochemisch, immunhistologisch und funktionell zu untersuchen. MAk ZP2-20 (Klon 24/4 C), der gegen ein synthetisches Peptid gerichtet ist, das speziesübergreifend (homolog) in ZP2 Proteinen vorkommt, konnte erfolgreich hergestellt werden. Immunhistochemische, immunelektronenmikroskopische und Immunfluoreszenz Untersuchungen zeigten, dass mAk ZP2-20 ZP2 Protein von verschiedenen Spezies detektierte. In Untersuchungen zur Expression der ZP2 kodierenden Gene mittels RT-PCR konnte eine mRNA Expression in murinen Eizellen und Ovargewebe gezeigt werden. In Kumulus-/Granulosazellgemischen konnte keine mRNA Expression nachgewiesen werden. Immunoblots zeigten, dass ZP2-20 mit einem 64 / 65 kDa Polypeptid reagierte, das menschlichen bzw. bovinen ZP2-Proteinen entspricht. Nach Einsatz von mAk ZP2-20 konnte im Kompetitions-Hemizona-Assay eine ZP2-Protein-Domäne identifiziert werden, die für die Spermatozoen-Zona pellucida Bindung von Bedeutung ist: Nach Vorbehandlung der Hemizonae mit monoklonalen ZP2-Peptid-Antikörpern war die Anzahl der gebundenen Spermatozoen deutlich herabgesetzt. Aus diesen Befunden kann geschlossen werden, dass die durch das ZP2-Peptid repräsentierte ZP2-Domäne für die feste Bindung von Samenzellen an die Zona pellucida von Bedeutung ist. Im Rahmen von Fertilitätsstudien in der Maus mit ZP2-20 Peptid als mögliche Vaccine im Vergleich zu Kontrollen, zeigte sich tendenziell eine Hemmung der Fertilität. Eine Beeinträchtigung der strukturellen Integrität des ovarialen Gewebes konnte nicht beobachtet werden. Die Untersuchungen zeigen, dass der monoklonale Antikörper mAk ZP2-20 gegen synthetisches Zona pellucida 2 Peptid als spezifische Marker für Zona pellucida Protein eingesetzt werden kann. Außerdem ist dieser Antikörper für Untersuchungen physiologischer Abläufe der Spermatozoen-Eizell-Interaktion geeignet. Die Bedeutung der Ergebnisse für Diagnostik und Therapie in der Reproduktionsmedizin sowie als Grundlage für innovative Konzepte im Bereich der Entwicklung von Kontrazeptiva wird sich in der Zukunft zeigen. In the mouse, the Zona pellucida 2 protein is responsible for the tight, secondary binding of spermatozoa to the Zona pellucida of the oocyte. In this dissertation monoclonal antibodies (mab) against a synthetic ZP2 peptide were generated. Monoclonal antibody ZP2-20 (clone 24/4 C) was used to identify ZP2 protein applying immunochemical, immunohistological and functional methods. The antibodies are directed against a synthetic peptide that is homologous in many mammalian ZP2 proteins. Immunohistochemistry, immunomicroscopy and immunofluorescence showed that mab ZP2-20 detected ZP2 protein in oocytes of different species. It also could be demonstrated that the expression of ZP2 mRNA occurs in murine oocytes and ovary tissue. However, in cumulus-/granulosa cell complexes, no ZP2 mRNA could be detected. Immunoblots revealed that ZP2-20 antibodies reacted with a 64 kDa and a 65 kDa polypeptide in human and bovine oocytes, respectively. In the bovine competitive hemizona assay mab ZP2-20 clearly inhibited binding of spermatozoa to the Zona pellucida. From the results obtained it can be concluded that the ZP2 peptide represents a ZP2 domain that is involved in the process of sperm-Zona pellucida interaction. Fertility studies with mice that where immunized with the ZP2-20 peptide tended to result in a decrease of fertility without affecting the morphological integrity of the ovary. From the data elaborated in this dissertation it can be concluded that mab ZP2-20 is a specific marker for Zona pellucida protein. Furthermore, this antibody can be used for the evaluation of the physiology of sperm-egg interaction. The results obtained might contribute to the understanding of crucial physiological events occuring during sperm-ZP2 interaction and provide a basis for novel immuno contraceptive approaches in humans and animals.