Elektrophysiologische Charakterisierung und pharmakologische Beeinflussung von durch Pneumolysin aus Streptococcus pneumoniae gebildeten Poren

Abstract

Pneumolysin (Ply) ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor von Streptococcus pneumoniae, einem Gram-positivem Bakterium, welches lebensbedrohliche Infektionen wie Meningitis, Pneumonie und Sepsis auslöst. Ply gehört zur Familie der Cholesterol-abhängigen Toxine und führt in hohen Konzentrationen zur Lyse von Zielzellen. In dieser Arbeit wurde erstmals direkt die Porenbildung durch Ply in sublytischer Konzentration elektrophysiologisch mit Hilfe der Patch-Clamp-Methode untersucht. Hierbei wurden HEK293-, NIH3T3- und BV2-Zellen eingesetzt. Ply führt konzentrationsabhängig zu transienten Porenöffnungen und -schließungen. Die Porenbildung ist an die Anwesenheit von Cholesterol in der Zellmembran gebunden. Es existiert eine elementare Ply-Grundpore mit einer Leitfähigkeit von 680 pS. Größere Porenströme kommen wahrscheinlich durch gleichzeitiges Öffnen von mehreren in Gruppen liegenden Grundporen zustande. Die Ply-Poren weisen keine Selektivität für die Kationen Na+, K+, Ca2+, Cholin, TEA und Arginin sowie für die Anionen Cl- und Glutamat auf. Durch die Ply-Poren fließt Ca2+ in die Zellen und es kommt zu einer transienten Zunahme der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Ein unmittelbarer Effekt ist die Aktivierung Ca2+-abhängiger, spannungsunabhängiger K+-Kanäle. Die durch Ply-Poren bedingte intrazelluläre Ca2+-Konzentrationserhöhung kann durch Ca2+-Freisetzung aus endogenen Speichern verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit gelang es erstmals, Substanzen zu finden, die den Ply-Porenstrom blockieren können. Durch die Metalle aus der Gruppe der Lanthanoide La3+, Gd3+, Yb3+ (je 100µM) sowie durch Al3+ (1 mM) wird der Ply-Porenstrom vollständig blockiert. Die Blockade ist konzentrationsabhängig und reversibel. Die als Ply-Porenblocker identifizierten Metalle weisen eine sehr ähnliche Konzentrations-Wirkungsbeziehung auf, wobei die 10fach geringere Potenz des Al3+ auffällt. Mit der Blockade von Ply-Poren könnten sich neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen, die die Antibiotikatherapie von invasiven Pneumokokken-Infektionen ergänzen könnten. Pneumolysin (Ply) is a major virulence factor of Streptococcus pneumoniae, a Gram-positive bacterium that can cause life-threatening diseases, such as meningitis, pneumonia and sepsis. Ply belongs to the group of cholesterol-dependent cytolysins and induces lysis of target cells at high concentrations. The present work demonstrates for the first time the pore formation induced by Ply in sublytic concentrations directly by using the patch-clamp technique. Using HEK293-, NIH3T3- and BV2-cells it was demonstrated that Ply leads to transient pore-openings and closings in a concentration-dependent manner. Pore formation by Ply depends essentialy on the presence of cholesterol within the plasma membrane. An elementary pore with a conductance of 680 pS was identified. Ply-induced pores most probably form clusters that exhibit synchronized opening and closing states. These Ply-formed pores are non-selective for cations such as Na+, K+, Ca2+, cholin, TEA and arginin and anions such as Cl- and glutamate. Ply-induced pore formation causes a transient increase of the intracellular Ca2+ concentration leading to a direct activation of Ca2+-dependent and voltage-independent K+-channels. Furthermore, the Ply-dependent Ca2+ influx can be amplified by intracellular Ca2+ stores. The present work describes for the first time substances that can block the current through Ply-induced pores. The lanthanoides La3+ (100 µM), Gd3+ (100 µM) as well as Yb3+ (100 µM) and the metal ion Al3+ (1 mM) caused a complete blockade of the pore current. The blockade is concentration-dependent and reversible. The metal ions that were identified as blockers of Ply pores exhibit similar dose-response-curves, in wich a tenfold lower potency of Al3+ becomes apparent. These new pore blockers could provide further therapeutic approaches to supplement the antibiotic therapy of pneumococcal diseases.