Untersuchungen zur Lokalisation und Funktion von ZP-Proteinen im Marmoset Modell

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden de-novo-Syntheseorte der ZP-Proteine im Ovargewebe des Marmoset-Affen mittels RT-PCR bestimmt. Weiterhin konnte mit Hilfe von anti-ZP-Peptid Antikörpern ZPA- und ZPC-Protein immunhistologisch und immun-elektronenmikroskopisch im Marmoset-Ovar lokalisiert werden; ergänzend dazu wurden die den antigenen Determinanten entsprechenden ZP-Peptiddomänen funktionell auf deren Bedeutung für die Spermatozoen-Zona Pellucida Bindung hin überprüft. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass polyklonale Anti-ZP-Peptid-Antiseren, die gegen homologe Aminosäuresequenzen in verschiedenen Spezies gerichtet sind, sowohl ZPA- als auch ZPC-Protein im Marmoset Ovar detektierten. Immun-Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das ZPA-Protein homogen innerhalb der Zona Pellucida verteilt war, während ZPC verstärkt im inneren Teil der Zona Pellucida zu finden war. Diese zweischichtige Anordnung von ZPC-Protein unterstützt die lichtmikroskopische Beobachtung, dass die Zona Pellucida des Marmoset-Affen bilamillär strukturiert ist. ZPA- und ZPC-Protein wurden auch im Ooplasma sowie in den umliegenden Kumuluszellen nachgewiesen. Auffällig war, dass die ZPA-Protein Immunreaktion innerhalb des Ooplasmas und in den umliegenden Follikelzellen im Vergleich zum ZPC-Protein deutlich stärker war. Dem Nachweis von ZP-Proteinen in Follikelzellen und den Hinweisen auf unterschiedliche ZP-Protein Verteilungsmuster in den Zellen des Marmoset Ovargewebes folgte die Beantwortung der Frage nach dem Syntheseort der ZP-Proteine. Mittels RT-PCR konnten in unterschiedlichen follikulären Entwicklungsstadien sowohl in Eizellen als auch in Follikelzellen die mRNA-Expressionen aller drei ZP-Protein kodierenden Gene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass im Marmoset-Ovar neben den Eizellen auch Follikelzellen ZP Proteine de novo synthetisieren. Zur Überprüfung der funktionellen Relevanz der in der Marmoset Zona Pellucida nachgewiesenen ZPA-Epitope wurde erstmals der Kompetitions-Hemizona-Assay eingesetzt. Hier zeigte sich, dass weder polyklonale Antiseren noch monoklonale Antikörper, die gegen die untersuchten ZP Proteindomänen gerichtet sind, die Spermatozoen-Zona Pellucida Interaktion bei Callithrix jacchus beeinflussen. Die im Rahmen der Dissertation erzielten Ergebnisse zur Lokalisation, Synthese und Funktion der ZP-Proteine im Marmoset-Ovar sind Grundlage für weitere Untersuchungen zur immun-kontrazeptiven Bedeutung von ZP-Proteinen und synthetischen ZP-Peptiden in Primaten. This study used anti-ZP peptide antibodies to localize ZPA and ZPC-Protein expression in the marmoset ovary via immunohistochemistry and transmission electron microscopy. RT-PCR was used to identify areas of de novo protein synthesis. Furthermore, the competition hemizona assay was used for the first time in the marmoset model to investigate the functional relevance of a specific ZPA epitope during spermatozoa-oocyte interaction. Using polyclonal anti-ZP-peptide-antisera, immunhistochemical experiments demonstrated the localization of ZPA and ZPC-Protein in ovarian sections. ZPA and ZPC-Proteins were detected in the zona Pellucida as well as in surrounding cumulus cells, whereas in the ooplasm and the follicle cells, immunostaining of ZPC-Protein was less intense compared to that of ZPA-Protein. In addition, the bilamellar structure of the marmoset zona Pellucida was visible when anti-ZPC antiserum was used in transmission electron microscopy to determine the disposition of ZPC-Protein within the zona Pellucida. These results raised the question of the localization of de novo synthesis and the functional relevance of ZP proteins in the marmoset monkey. Therefore, mRNA was isolated from marmoset oocytes and oocyte-free follicle cells and used for RT-PCR. The mRNA expression of every ZP gene was demonstrated in oocytes as well as in follicle cells at different stages of folliculogenesis. These results make it highly likely that the de novo synthesis of ZP proteins is possible in both egg cells and follicle cells in the marmoset. The competition hemizona assay was used in the marmoset model for the first time to evaluate the functional relevance of a specific ZPA domain during the spermatozoa-egg interaction. It was shown that the capacity of sperm binding to the marmoset zona Pellucida was not influenced by the use of the polyclonal antiserum AS ZPA-20 nor by the application of the monoclonal antibodies mAb ZPA-20, but further study is needed before a definitive statement can be made.In conclusion, the results of this investigation deepen our understanding of the localization, distribution, and synthesis of ZP proteins as well as the physiological relevance of ZPA-Protein during the interaction of spermatozoa and oocytes in the marmoset model.