HPLC-Methode zur Messung von Leukotrienen im Liquor cerebrospinalis bei Patienten mit Subarachnoidalblutung

Abstract

Zur Messung von LTC4, LTD4 und LTE4 im Liquor cerebrospinalis bei Patienten mit Subarachnoidalblutung wurde ein HPLC - Verfahren entwickelt, das den ersten Extraktionsschritt durch eine Vorsäule ersetzt, die durch ein Schaltsystem an die Hauptsäule gekoppelt wird. Davor erfolgte lediglich eine einfache Aufbereitung durch Zugabe von MeOH und 20 - TFE4 als interner Standard zur Probe sowie eine nachfolgende Ultrafiltration. Nach Testung mehrerer Säulen wurde die Pinkerton 4,6 x 250 mm bei einer Flussmittelzusammensetzung von 55% MeOH : 45% wässriger Acetat - Lösung (0,1%, pH 7,2) als Vorsäule zur 4 x 250 mm Inertsil ODS - Hauptsäule mit einer Flussmittelzusammensetzung von 68% MeOH : 32% Acetat - Puffer (0,1%, pH 5,6) verwendet. Die abschließende Elution der Substanzen erfolgte in der Reihenfolge 20 - TFE4, LTE4, LTD4 und LTC4. Dabei wurde LTC4, das bei Subarachnoidalblutungen und anderen Hirnerkrankungen im Hinblick auf die Entwicklung eines Vasospasmus besondere Relevanz zeigt, besonders gut getrennt.Nach Sammlung von Fraktionen wurde deren Quantifizierung mittels eines ELISA durchgeführt. Bei 35 Liquorproben von 10 Patienten mit Subarachnoidalblutung, die aus unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Ereignis stammten, waren LTC4, LTD4 und LTE4 mit 459 ± 516 pg/ml, 187 ± 146 pg/ml und 206 ± 128 pg/ml im Vergleich zu den 5 Kontrollproben mit 147 ± 45 pg/ml, 176 ± 108 pg/ml und 128 ± 128 erhöht.Diese Tendenz zeigte sich vor allem für LTC4 auch bei anderen Autoren. Je 10 mit internem Standard und Cys - LT dotierte H2O und Liquorproben aus einem Pool zeigten durchschnittliche Widerfindungsraten von 88,8 ± 5,2% bzw. 71,9 ± 3,6%, während die 20 - TFE4 - Werte im Patientenliquor bei 75,5 ± 18,6% lagen. Die Spezifität des Verfahrens wies beim t - Test für unabhängige Variablen ein p < 0,01 auf. Aufgrund der geringen Diskrimination der Leukotriensubtypen nach der Ultrafiltration und des fehlenden Vorkommens von 20 - TFE4 im menschlichen Organismus konnte 20 - TFE4 als Maß für den Substanzverlust herangezogen werden. Die Sensitivität für die zu bestimmenden Cys - LT lag nach einer Verdünnungskurve bei 0,5 ng/Injektion und war damit im unteren Bereich der bei biologischen Proben vorkommenden Konzentrationen. Durch den ELISA wurde sie auf 10 pg/ml angehoben. Bei insgesamt guter Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit wäre durch eine Automatisierung von Probeneinspritzung, Ventilfunktion und Probensammlung auch eine Anwendbarkeit dieser Methode in der Routinediagnostik gegeben. Eine Analyse von Plasma und unter entsprechender Aufbereitung auch von Urin ist denkbar. Das Verfahren ist gegenüber HPLC - Methoden mit manueller Kartuschenextraktion aufgrund der Vortrennung über eine Chromatographie in einer Vollsäule überlegen. Zudem ist die Durchführbarkeit schneller und die Widerfindungsraten sind insgesamt besser. Die klinische Konsequenz einer Leukotrienbestimmung im Liquor könnte neben der Verlaufsdiagnostik auch therapeutische Schritte beinhalten (z.B. Gabe von Leukotrienantagonisten bei Vasospasmus der Cerebralgefäße). A HPLC proceedure for the measurement of LTC4, LTD4 and LTE4 in cerebrospinal fluid of patients with subarachnoid hemorrhage was developed, which replaces the usual extraction step through the addition of methanol and internal standard (20-TFE4), an ultrafiltration, and a pre-column, which was coupled via a switching valve system to the main column. After evaluating several columns the Pinkerton 4,6 x 250 mm with a mobile phase composition of 55% MeOH : 45% aqueous acetate solution (0,1%, pH 7,2) was used as pre-column to the 4 x 250 mm Inertsil ODS main-column with a mobile phase composition of 68% MeOH : 32% acetate buffer (0,1%, pH 5,6). The elution sequence was, respectively: 20-TFE4, LTE4, LTD4 and LTC4. LTC4, which shows special relevance in subarachnoid haemorrhage and other brain diseases in regard to the development of a vasospasm, was especially well separated. After collection of their fraction the quantification was accomplished by means of an ELISA. In 35 samples of cerebrospinal fluid from 10 patients with subarachnoid haemorrhage, obtained at different times after the event, LTC4, LTD4 and LTD4 were 459 ± 516 pg/ml, 187 ± 146 pg/ml and 206 ± 128 pg/ml, respectively. In comparison the 5 reference samples were lower: 147 ± 45 pg/ml, 176 ± 108 pg/ml and 128 ± 128 pg/ml, respectively. This tendency was most pronounced for LTC4 as reported by other authors as well.1 0 samples of H2O and cerebrospinal fluid from a pool, each spiked with internal standard and Cys-LT, showed average recoveries of 88,8 ± 5,2% and 71,9 ± 3,6%, while the 20-TFE4 values in cerebrospinal fluid of patients were 75,5 ± 18,6 %. The specificity of the procedure in the t test for independent variables showed a p of < 0,01. Based on the low discrimination of the leucotriene subtypes after the ultrafiltration, and the missing occurrence of 20 TFE4 in the human organism, 20 TFE4 could be used as an indicator for the material loss.According to a dilution curve the sensitivity for the determined Cys LT was about 0,5 ng/injection, and was thereby, in the lower range of the concentrations occurring with biological samples. It was improved to10 pg/ml by the ELISA. The good sensitivity, specificity, and reproducibility of this method would make it useful for routine diagnostics if sample injection, valve function, and sample collection were automated. An analysis of plasma, and under suitable preparation also of urine, is conceivable.Compared to HPLC methods with cartridge extraction this method is superior due to a pre separation by a full-sized column. Furthermore, it is faster and the recovery rates are higher. The clinical consequence of a leucotriene analysis in the cerebrospinal fluid could be to allow therapeutic steps (e.g. application of leucotriene antagonists in cerebral vasospasm) besides the progress diagnostics.