Molekulare Komponenten des cholinergen Systems in mikrodisseziertem Trachealepithel der Ratte

Abstract

Nachmansohn und Machado zeigten 1943, dass neuronales ACh durch die ChAT aus AcetylCoA und Cholin synthetisiert wird (NACH-MANSOHN ET AL. 1943). Cholin wird über den hochaffinen CHT1 in die Zelle aufgenommen. Dies ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der ACh Synthese (OKUDA ET AL. 2000A/B, APPARSUNDARAM ET AL. 2000). Der hochaffine Cholintransport ist seit längerem bekannt, das verantwortliche Protein konnte erst im Jahre 2000 durch Okuda et al. kloniert werden (OKUDA ET AL. 2000A/B). ACh existiert nachgewiesenermaßen in nicht-neuronalen Geweben. Ein-zelne, nicht-neuronale Komponenten des cholinergen Systems konnten bisher in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe, wie z.B. in Haut/Haarfollikeln, Pulmonalarterien und Keratinozyten, mittels verschiedenster Methoden nachgewiesen werden (JOHANSSON ET AL. 1993, GRANDO ET AL. 1993, HABERBERGER ET AL. 2000). Die bisherigen Untersuchungen über nicht-neuronale Komponenten des choliner-gen Systems wiesen bisher nur einzelne Bestandteile in verschie-denen Geweben nach. Ein Nachweis, dass CHT1, ChAT und VAChT gleichzeitig im selben nicht-neuronalen Gewebe existieren, wurde bisher nicht erbracht. Daraus ergeben sich, exemplarisch für das Trachealepithel der Ratte, folgende Fragestellungen:

Lassen sich auf molekularer Ebene die mRNAs von CHT1, VAChT und ChAT im Trachealepithel der Ratte nachweisen? Kann darüber hinaus VAChT Protein mittels Immunfluoreszenz im Trachealepithel gezeigt werden? Ist es mit Hilfe der laserunterstützten Mikrodissektion mög- lich, Trachealepithel der Ratte für eine anschließende mRNA Analyse zu gewinnen? Kann eine differenzierte Isolierung der einzelnen Trachealepithel-zellen mittels der laserunterstützten Mikrodissektion erfolgen?Mittels der laserunterstützten Mikrodissektion ist es aufgrund tech-nischer Gegebenheiten des Lasers sowie der Vorbereitung der Trachealschnitte zur Mikrodissektion nicht möglich, einzelne der 6 verschiedenen Zelltypen des Trachealepithels gezielt zu isolieren. Es konnte jedoch für den Gesamtverband mRNA für CHT1, ChAT und VAChT nachgewiesen werden. Darüber hinaus gelang es durch Immunfluoreszenzuntersuchungen am selben Gewebe, das VAChT Protein in den Vesikeln sekretorischer Zellen im apikalen Zellanteil nachzuweisen. Demzufolge speichern im Epithel nur sekretorische Zellen ACh vesikulär und setzen es dann exozytotisch frei. In anderen Zelltypen des Trachealepithels scheint eine andere Speicher- bzw. Freisetzungsform vorzuliegen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit sowie weiterer Untersuchungen der Arbeitsgruppe (PFEIL ET AL. 2003A/B) ist eine luminale Sekretion des epithelial synthetisierten ACh anzunehmen. Hier kann ACh zum einen an der Steuerung epithelialer Funktionen, wie z.B. Steigerung der Schlagfrequenz von Zilien oder Stimulation der Muzinfrei-setzung, beteiligt sein (DWYER ET AL. 1992, WESSLER ET AL. 2001D). Darüber hinaus ist an eine cholinerge Regulation intraluminal befindlicher Zellen, wie z.B. Makrophagen, zu denken. Neben dieser luminalen Sekretion konnte kürzlich eine basal gerichtete Abgabe von ACh gezeigt werden. Moffatt et al. zeigten eine durch Serotonin vermittelte Bronchokonstriktion, welche maßgeblich durch ACh-Freisetzung aus dem Epithel induziert wurde (MOFFAT ET AL. 2004). Für die basolaterale ACh-Freisetzung im respiratorischen Epithel ist am ehesten OCT3 verantwortlich, da weder CHT1 in der basolateralen Membran noch VAChT in basal sezernierten Vesikel nachweisbar ist (LIPS ET AL. 2004). Zusammenfassend weist das Trachealepithel an der luminalen Seite die von Neuronen bekannten molekularen Komponenten des cholinergen Systems auf, während eine basolaterale Freisetzung über andere Wege erfolgt.

In 1943 Nachmansohn and Machado demonstrated that neuronal acetylcholine (ACh) is synthesized by the enzyme choline acetyl-transferase (ChAT) from acetylCoA and choline (NACHMANSOHN ET AL. 1943). The rate-limiting step in ACh synthesis is choline uptake into the cell via the membrane-bound high-affinity choline transporter, CHT1 (OKUDA ET AL. 2000A/B, APPARSUNDARAM ET AL. 2000). While the kinetics of this transport have been known for long time, the transporter itself has been cloned rather recently by Okuda et al. (OKUDA ET AL. 2000A/B). ACh is not restricted to the nervous system but exists also in non-neuronal tissues. Individual components of the cholinergic system have been identified by several methods in a variety of cells and tissues, e.g. keratinocytes, skin, hair follicles, and pulmonary arteries (JOHANSSON ET AL. 1993, GRANDO ET AL. 1993, HABERBERGER ET AL. 2000). These studies have focussed only upon indivi-dual components of the cholinergic system while a simultaneous demonstration of CHT1, ChAT and VAChT within the same tissue is so far lacking. Thus, the following questions have been raised and investigated in the rat tracheal epithelium, serving as a model system:

Does the rat tracheal epithelium express mRNAs coding for CHT1, ChAT and VAChT? Can VAChT protein be detected in tracheal epithelial cells by immunofluorescence? Is laser-assisted cell picking a suitable method to collect tracheal epithelium for RT-PCR analysis? Does laser-assisted cell picking allow to isolated individual epithelial cell types from the tracheal epithelium? Due to technical limits of the laser system as well as due to the methodological requirements for preparation of tissue sections it turned out to be impossible to isolate either of the 6 different epithelial cell types individually. In conjunction, however, rat tracheal epithelium could be collected by laser-assisted cell picking and expression of CHT1, ChAT and VAChT was detectable in these samples by RT-PCR. VAChT protein was localized in secretory vesicles of secretory epithelial cells by means of immunofluorescence. Hence, vesicular storage and exocytotic release of ACh in the epithelium appears to be restricted to secretory cells while other epithelial cells store and release ACh via different mechanisms. These data, together with further findings obtained by our laboratory (PFEIL ET AL. 2003A/B), suggest a luminal release of ACh in the rat trachea. Here, ACh participates in the regulation of epithelial functions such as increase in ciliary beat frequency and stimulation of mucous secretion (DWYER ET AL. 1992, WESSLER ET AL. 2001D). In addition, a cholinergic influence on intraluminal cells, e.g. macrophages, has to be considered. Besides this luminal secretion, a basally directed release has recently been shown. Moffatt et al. demonstrated that serotonin-induced constriction of the mouse trachea is, to a large extent, mediated by ACh released from the epithelium (MOFFAT ET AL. 2004). This release is most likely mediated by OCT3 (LIPS ET AL. 2004) since neither basally located VAChT positive vesicles nor CHT1 in the basolateral membrane could be detected in the present study. In conclusion, tracheal epithelial cells exhibit at their luminal side molecular components of the neuronal cholinergic system whereas basolateral release of ACh is mediated differently.