Evaluation ausgewählter Angiogenese-Inhibitoren in einem in vitro Modell der Angiogenese

Abstract

Der Verlauf vieler Erkrankungen (z.B. koronare Herzkrankheit, Diabetes mellitus,Tumoren, rheumatoide Arthritis) wird durch Angiogenese entscheidendbeeinflusst. Valide Angiogenese-Modelle sind eine Voraussetzung zurErforschung angiogener Mechanismen und zur Entwicklung angiogener undantiangiogener Substanzen. In der vorliegenden Arbeit gelingt die Etablierung eines Mikroshären-gestützten 'Sprouting' Assays (SpA) durch Verwendung boviner retinaler Endothelzellen (BREC). Dieser SpA wird als gut definierter und in der Durchführung einfacher Angiogenese-Assay vorgestellt, der viele Teilschritte physiologischer Angiogenese erfasst. Zunehmend wird die Bedeutung der Dimensionalität von Angiogenese-Assayserkannt. Als primär 3-D in vitro Modell kommt der BREC-SpA physiologisch 3-D ablaufender Angiogenese sehr nahe. Dabei kann der BREC-SpA insbesondereauch als Modell für retinale Neovaskularisationen dienen. bFGF und VEGF sind verantwortlich für die Angiogenese-Induktion im BRECSpA.TNF-alpha bleibt im gezeigten Angiogenese-Kontext ohne Wirkung. Erhöhung der Fibrinogen-Konzentration innerhalb physiologischer Werte hateinen antiangiogenen Effekt im BREC-SpA. Thrombin wirkt in höheren Konzentration angiogen bei Zugabe ins Medium. DerEffekt von 'Medium-Thrombin' ist wohl matrixunabhängig und vermutlichdirekten Wirkungen auf die Endothelzelle zuzuschreiben. Aprotinin ist im BREC-SpA ohne angioregulatorische Wirkung und daherredundant. Der pH-Wert ist eine wichtiger Angiogenese-regulierender Faktor. Die komplette Applikation von Testsubstanzen ins Versuchsmedium führt zurmethodischen Vereinfachung des BREC-SpA und vermindert das Risikounspezifischer Effekte durch (z.B.) pH-bedingte Veränderungen derMatrixstruktur. ECGF/H ist ein potenter angiogener Faktor (aF) im BREC-SpA. ECGF/Hbewirkt teilweise nicht quantifizierbare Sp und sollte daher nicht alsStandardsubstanz im BREC-SpA verwendet werden. Die Produktion von Angiostatin (AS) durch uPA-Proteolyse von Plasminogen(Plg) und Reduktion von Plasmin durch Sulfhydrylgruppen-Donatoren (SHD) istreproduzierbar. Im Vergleich mit Plg-Proteolyse durch Elastase ergibt uPA/SHD-AS-Herstellungeine AS-Variante, die sowohl elektrophoretisch wie auch durch N-terminaleSequenzierung unterschieden werden kann. cRGD und TGF-beta1 sind potente Angiogenese-Inhibitoren (AI) im BREC-SpAund können als Kontrollsubstanzen zum Screening nach neuen AI fungieren. TGF-beta1 zeigt seine AI-Potenz abhängig vom aF und dient als Beispiel für die Kontext-Abhängigkeit von Angiogenese. AS und Endostatin sind im BREC-SpA und in Proliferationsassays mit BRECund humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) ohne antiangiogeneWirkung. Die Ursache der in diesem Kontext fehlenden Wirksamkeit ist unklar. Das in dieser Arbeit vorgestellte Angiogenese-Modell und die dargestelltenSubstanzwirkungen leisten einen Beitrag zur Erforschung der angiogenenMechanismen und Faktoren. Die komplexen Interaktionen im 'Angiogenese-Kontext' müssen weiter intensiv untersucht werden, dafür bietet der BREC-SpAausgezeichnete Voraussetzungen. The course of many diseases (for example ischaemic heart disease, diabetesmellitus, tumors and rheumatoid arthritis) are affected critically by Angiogenesis. Valid models of Angiogenesis are a prerequisite for research on angiogenicmechanisms and for the development of angiogenic and antiangiogenicsubstances. This paper describes the establishment of a microcarrier-based sprouting assay(SpA) by using bovine retinal endothelial cells (BREC). This angiogenesis assayrepresents a well defined system, which is characterized by its technical simplicityand which includes many steps that take place in physiological Angiogenesis. Researchers focus increasingly on the dimensionality of Angiogenesis assays. As a primarily three dimensional in vitro assay the BREC-SpA closely relates to threedimensionally occurring physiological Angiogenesis. The BREC-SpA canespecially serve as a model for retinal neovascularization. bFGF and VEGF promote Angiogenesis in the BREC-SpA. TNF-alpha does noteffect Angiogenesis in this context. An increase of Fibrinogen concentrations within physiological range results in anantiangiogenic response in the BREC-SpA. Thrombin promotes Angiogenesis in higher concentrations when added to thecell medium. The angiogenic effect of Thrombin in the medium seems to beindependent of the matrix and probably is due to direct effects on the endothelialcells. Since Aprotinin does not have any effect on Angiogenesis it is redundant in theBREC-SpA. The pH is important in regulation of Angiogenesis. The complete application of test substances into the assay medium results in amethodic simplification.Also, it decreases the risk of unspecific effects caused bymodifications of matrix structure, for example due to pH effects. ECGF/H is a potent angiogenic factor in the BREC-SpA. Since ECGF/Hpartially leads to the development of sprouts that can not be quantified it shouldnot be used as a routine substance in the BREC-SpA. Production of Angiostatin by proteolysis of Plasminogen by uPa and reduction ofPlasmin by Sulfhydrylgroup donators (SHD) is a reproducible method. Compared to proteolysis of Plasminogen by Elastase the method using uPA andSHD generates an Angiostatin form that can be distinguished by electrophoresisas well as by N-terminal sequencing. cRGD and TGF-beta1 act as potent Angiogenesis inhibitors in the BREC-SpA.Therefore these substances can be used as a control when screening for newAngiogenesis inhibitors. The antiangiogenic potential of TGF-beta1 depends on the applied angiogenicfactor and therefore serves as an example for contextual dependency ofAngiogenesis. Angiostatin and Endostatin do neither show any antiangiogenic effect in theBREC-SpA nor in proliferation assays with BREC and HUVEC. The cause oftheir lacking potential in this context is not known. The Angiogenesis model presented in this work as well as the demonstratedeffects of substances contribute to the research of angiogenic mechanism andangiogenic factors. The BREC-SpA provides excellent conditions for furtherresearch on the complex interactions of the context of Angiogenesis, whichneed to be investigated more thoroughly.