Development of a DNA transfer technique for human lung cells with synthetic peptide Tat-RGD and its application for regulatory and functional analysis of RELMB

Abstract

The presented study is organized in two sections. In the first part a DNA-transfection procedure for human lung cells employing a peptide conjugate has been established and the corresponding transfection process characterized. In the second part this new transfection strategy has been applied for studying functional aspects of the human RELMBbeta gene. Cell-lines and primary cells exhibit a varying degree of resistance to DNA transfection strategies. In this study, we employed the synthetic peptide TatRGD (TR), composed of the HIV-1 derived translocation peptide Tat fused to the integrin binding RGD motif, as a tool for improving DNA transfer into human pulmonary cells. Binding experiments between DNA and TR and cytotoxicity measurements of TR treated cells were undertaken to optimize DNA and TR concentrations for transfection. Addition of a complex of TR and DNA (TRD) to A549 cells yielded in significant transgene expression. When combining TRD with Lipofectamine (TRDL), the expression was increased by 5-fold over Lipofectamine (DL) and by ~30-fold over TRD mediated transfections. Also, in primary smooth muscle cells (SMC) and fibroblasts (FB) derived from pulmonary arteries, an increase in TRDL mediated transfection efficiency was observed by a factor of ~ 2 and ~ 3 over that of DL. Laser scanning confocal microscopy for visualizing TR dependent DNA uptake demonstrated that the internalization of TRDL complexes is linked to caveoli in the plasma membrane. Interfering caveoli formation by methyl-b-cyclo-dextrin drastically decreased the transfection efficiency by TR. In conclusion, the TatRGD peptide mediates efficient gene delivery in human pulmonary cells, in particular when combined with standard cationic lipid based transfection reagent. The enhancement of DNA uptake by TatRGD is suggested to be mediated by caveoli dependent endocytosis. RELMBbeta(resistin-like molecule) represents the most related human homologue of mouse RELMBbeta also known as hypoxic-induced-mitogenic-factor (HIMF) for which no human orthologue gene exist. In this part of the study, we isolated RELMBbeta cDNA from human lung tissue and performed regulatory and functional expression studies with the TatRGD procedure. RELMBbeta mRNA was upregulated in hypoxia in human lung A549 cell line as well as primary cultured adventitial fibroblasts (FB) and smooth muscle cells (SMC) of pulmonary artery. Upon transfection of a RELMBbeta encoding expression plasmid into these cells, we observed significant induction of proliferation particularly in SMC and A549 cells. The results suggest that human RELMBbeta may contribute to hypoxic induced pulmonary vascular remodeling processes or hypoxia related fibrotic lung disease. Die vorgelegte Studie ist in zwei Abschnitte gegliedert. Im ersten Teil wird eine DNATransfektions Prozedur mit Hilfe eines Peptid-Konjugats etabliert und der zugehörige Transfektions Prozess charakterisiert. Im zweiten Teil wird diese Transfektions Strategie angewendet, um funktionelle Aspekte des humanen RELMBbeta Gens zu untersuchen. Zelllinien und primäre Zellen zeigen eine unterschiedliche Resistenz gegenüber DNATransfektions Methoden. In dieser Studie wurde das synthetische Peptid TatRGD (TR), das aus dem von HIV-1 abgeleitetem Translokations Peptid Tat und dem Integrin bindenden RGD Motiv zusammengesetzt ist, genutzt, um den DNA Transfer in humane pulmonale Zellen zu begünstigen. Bindungsexperimente zwischen DNA und TR, sowie Zytotoxizitäts Messungen von TR behandelten Zellen wurden durchgeführt, um die zu verwendenden DNA und TR Konzentrationen zu optimieren. Zugabe eines Komplexes von TR und DNA (TRD) zu A549 Zellen resultierte in signifikanter transgener Expression. Die Kombination von TRD und Lipofectamin (TRDL) verstärkte die Expression 5-fach gegebenüber Lipofectamin (DL) und 30-fach gegenüber TRD vermittelter Transfektion. Ebenso in primär kultivierten glatten Muskelzellen (SMC) und adventitialen Fibroblasten (FB), die aus Pulmonalarterien gewonnen wurden, wurde eine Steigerung der Transfektionseffizienz um den Faktor 2 bzw. 3 gegenüber DL beobachtet.Laser-Scan basierte konfokale Mikroskopie zeigte, dass die TR abhängige DNA Aufnahme abhängig von Caveolae in der Plasmamembran ist. Inhibition der Caveolae Bildung durch Methyl-b-Cyclo-Dextrin verminderte drastisch die Transfektions Effizienz durch TR. Zusammengefasst, vermittelt TatRGD einen effizienten DNA Transfer in humane pulmonale Zellen, insbesondere wenn es mit Transfektions Reagenzien, die auf kationischen Lipiden basieren, kombiniert wird. Die Steigerung der DNA Aufnahme wird vermutlich durch Caveolae-abhängige Endozytose vermittelt. RELMBbeta(resistin-like molecule) repräsentiert das am nächsten homologe Gen von RELMBbeta der Maus, das auch unter dem Namen HIMF (hypoxic-induced-mitogenicfactor) bekannt ist, für das aber kein orthologes humanes Gen existiert. In diesem Teil der Studie isolierten wir RELMBbeta cDNA von humanem Lungen Gewebe und führten funktionelle Expressions Studien mittels der TatRGD Methode sowie Untersuchungen zu seiner Regulation durch. Wir beobachteten eine Hochregulation von RELMBbeta mRNA in Hypoxie in der epithelialen humanen Lungenzellinie A549 sowie in primär kultivierten FB und SMC der Pulmonalarterie. Nach Transfektion der Zellen mit einem Expressions plasmid kodierend für RELMBbeta beobachteten wir eine signifikante Induktion der Proliferation insbesondere in SMC und A549 Zellen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass humanes RELMBbeta am pulmonal-arteriellen Remodeling Prozess in Hypoxie oder an Hypoxie-assozierten fibrotischen Lungenerkrankungen beteiligt sein könnte.