Fremdgentransfer in Glioblastomzellen mittels Listeria monocytogenes-Vektoren

Abstract

In dieser Arbeit werden Experimente zum Gentransfer in humane Glioblastomzellen mit einem Genvektorsystem, basierend auf dem fakultativ intrazellulären Bakterium Listeria moncytogenes 1/2a, beschrieben. Die Untersuchung der Listerieninvasion in 2 etablierte Gliomzellinien sowie 27 Primärkulturen intraoperativ entnommener Hirntumorpräparate zeigte, daß L.monocytogenes in der Lage ist, humane Hirntumorzellen zu invadieren. Die stärkste absolute Listerien-Wildtypinvasion wurde dabei unter den astrozytären Tumorzellen beobachtet. Die Invasion in diese Tumorzellen war deutlich von der Aktivität der bakteriellen invasiven Virulenzgene Internalin A und B abhängig. Die plasmidgesteuerte Überexpression dieser Virulenzgene in den verwendeten Listerienstämmen resultierte gegenüber Wildtyplisterien in einer auf 215% gesteigerten mittleren Invasion in astrozytäre Tumorzellen. Durch Deletion beider Internalingene hingegen wurde die bakterielle Invasion in astrozytäre Zellen im Mittel auf 50% reduziert. Als Reportergene des Fremdgentransfers wurden lacZ und EGFP gewählt. Mit hierfür konstruierten Plasmidvektoren konnte per Lipofektion in astrozytäre Zellen die intrazelluläre Fremdgenaktivität festgestellt werden. Durch Transformation der Plasmidvektoren in Listeria monocytogenes1/2a wurden komplementierte Listerien-Stämme generiert, deren Eignung zum vektoriellen Fremdgentransfer in astrozytäre Zellen zu untersuchen war. Derart komplementierte Wildtypstämme von Listeria monocytogenes waren in der Lage, die gewählten Reportergene in humane Zellen zu transportieren. Transferraten von bis zu 70% wurden in Zellen der epithelialen Zellinie 293T beobachtet. Die Transfereffizienz in den untersuchten astrozytären Zellen lag zwischen 3-5%. Eine Transferrate von mehr als 10% sollte für einen therapeutischen Gentransfer (von beispielsweise Suizidgenen) angestrebt werden. Unter anderem durch Veränderung der Virulenzfaktorausstattung des Vektors, spezifiziertes Targeting der Wirtszelle und durch Optimierung der Fremdgene für die intrazelluläre Transkription und Translation könnte eine weitere Steigerung der Transfereffizienz erreicht werden. Experiments for gene transfer into human glioblastoma cells using the facultative intracellular bacterium listeria monocytogenes are described in the presented paper. Examination of bacterial invasion into stable glioblastoma cells and primary cell cultures of different intracranial tumors did show, that listeria are able to enter these cells, depending on the cell origin and the existing bacterial virulence factors. The strongest absolute invasion of wild type listeria monocytogenes was observed in cells of astrocytic origin. Using bacterial mutants with deletion of the virulence genes internalin A and B results in a distinct reduced invasion in astrocytic cells (50%), whereas overexpression of this genes by a privileged transcribed plasmid could essentially increase the invasion number of the listeria mutants (215%). For the gene transfer studies two reporter genes, lacZ and EGFP, in special constructed plasmids were used. Via lipofection these reporter gene containing plasmids were conducted into human cells and the activity of the foreign genes was observed by fluorescens microscopy and the b-galactosidase staining assay. These reporter gene containing plasmids were transfered to listeria monocytogenes protoplasts and after culturing of the bacteria a complete bacterial gene transfer vector system was created, able to invade human brain tumor cells and to deliver the foreign genes. More than 70% of 293T cells, a human renal epithelial cell line, could succesfully transfected in the developed transfer procedure. However in glioblastoma cells this transfer rate could not increased up to 10%. This number should be reached at least to detect significant therapeutic effects, for instance in suicide gene transfer protocols. By optimizing more factors of the three interacting instances (bacterium, plasmid vector and host cell) a higher transfer rate could result.