Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus der Plazenta : Etablierung eines Modells zur plazentaren Angiogenese

Abstract

Die Entwicklung des Gefäßsystems in der Plazenta ist Voraussetzung für einen adäquaten Gasaustausch, für den Transport von Nährstoffen zwischen Mutter und Fetus und somit für eine normale embryonale Entwicklung und das fetale Wachstum. Die Bildung neuer Blutgefäße in der Plazenta als fetalem Organ erfolgt im Rahmen der Vaskulogenese und Angiogenese. Während der Vaskulogenese bilden Endothelvorläuferzellen (Angioblasten) ein primitives Gefäßgeflecht aus. Der Ausbau eines komplexen Gefäßsystemes erfolgt im Rahmen der Angiogenese. Hierbei kommt es zunächst zur Steigerung der Gefäßpermeabilität und Auflösung der Basalmembran bereits existierender Blutgefäße mit anschließender Proliferation und Migration von Endothelzellen zu den Orten der Gefäßneubildung. Dort kommt es zunächst zur Formation röhrenförmiger Strukturen, die nach Assoziation mit glatten Muskelzellen bzw. Perizyten im Zusammenspiel mit Angiogenesefaktoren zu intakten Blutgefäßen maturieren. Die Angiogenese in der Plazenta ist ein Prozeß, der sich in der Mikrovaskulatur abspielt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, daß nicht nur Endothelzellen verschiedener Organe unterschiedliche Aufgaben erfüllen, sondern daß sich auch die Eigenschaften makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen deutlich unterscheiden. Bisher wurden als in vitro Modell der Angiogenese vor allem Endothelzellen aus der Nabelschnurvene verwendet. Diese sind einfach in der Gewinnung und Kultivierung, es handelt sich jedoch um makrovaskuläre extraplazentare Endothelzellen. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell basierend auf plazentaren mikrovaskulären Endothelzellen etabliert. Die Isolierung der Endothelzellen erfolgte aus dem Zottengewebe frischer Plazenta. Nach der Präparation von Mikrogefäßen erfolgte ein Verdau mit Kollagenase und Trypsin. Nach der Filtration der Suspension durch ein Zellsieb wurde die so gewonnene Mischkultur kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde mittels FACS analysiert, wobei sich nur ein geringer Anteil endothelialer Zellen und ein großer Anteil stromaler und trophoblastischer Zellen zeigte. Der andere Teil wurde mit Hilfe von CD 105 MicroBeads aufgereinigt, wobei die magnetischen Beads mit dem Oberflächenmolekül CD 105 reagieren, welches sehr stark auf Endothelzellen, die sich in der Angiogenese befinden, exprimiert wird. Die Charakterisierung der erhaltenen Endothelzellkultur erfolgte mittels FACS Analyse. Hierbei konnte die endotheliale Herkunft der Zellen anhand von spezifischen Oberflächenmarkern (CD 31, CD 144, vWF, VEGFR-2) aufgezeigt werden. Außerdem wurde die Aufnahme von Dil-Ac-LDL demonstriert, die endothelialen Zellen vorbehalten ist. Die etablierte Methode zur Gewinnung von plazentaren mikrovaskulären Endothelzellen ist einfach reproduzierbar und bietet ein in vitro Modell, welches zum besseren Verständnis der Gefäßneubildung während der Schwangerschaft und somit zur Erschließung neuer therapeutischer Ansätze bei der Behandlung vaskulärer Störungen während der Schwangerschaft beitragen soll. Normal fetal growth and development, including an adequate gas exchange as well as the transport of nutritions between mother and fetus, requires the development of placental vasculature. The two distinct processes defining the formation of new blood vessels in the fetal organ placenta are called vasculogenesis and angiogenesis. During vasculogenesis endothelial percursor cells (angioblasts) build up a formation of primitive vascular structure. The sprouting of capillaries from preexisting blood vessels takes place during angiogenesis. In angiogenesis the proteolytic degradation of the extracellular matrix is followed by proliferation and migration of endothelial cells towards the locations of new blood vessel formation. After the formation of tube-like structures and their association with pericytes and smooth muscle cells, mature blood vessels can develop with the help of angiogenic growth factors. Angiogenic processes in the placenta take place in the microvasculature. In recent years it became clear that endothelial cells display remarkable heterogeneity in different organs. In addition to that it was found that macrovascular and microvascular endothelial cells display different features. Until now mostly endothelial cells from umbilical cord vein were used as an in vitro model for angiogenesis. These cells can easily be isolated and cultured but represent macrovascular extraplacental endothelial cells. An in vitro model based on placental microvascular endothelial cells was established within this thesis. Fresh placental villous tissue was used for the isolation of endothelial cells. Preparation of microvessels was followed by digestion with collagenase and trypsin. The filtrate of the cell suspension was cultured. One part of this mixed culture was analyzed by FACS. Only few endothelial cells could be detected whereas the major part turned out to consist of stromal and trophoblastic cells. The other part of the mixed culture was purified with CD 105 MicroBeads. These magnetic beads react with CD 105, which is highly expressed by endothelial cells that are involved in angiogenesis. The endothelial cell culture was characterized by FACS using specific antibodies (CD 31, CD 144, vWF, VEGFR-2) to show the endothelial origin of the cells. The absorption of Dil-Ac-LDL which is considered as one of the most sensitive markers for endothelial cells could also be demonstrated. This method for isolation and cultivation of placental microvascular endothelial cells is easily reproducible. Used as an in vitro model it might lead to a better understanding of placental vessel formation during pregnancy and might allow the establishment of new therapeutic strategies for the treatment of pregnancy related vascular pathology.