Physiologisch-biochemische und genetische Charakterisierung der Spezies Malassezia pachydermatis unter besonderer Berücksichtigung einer pigmentbildenden Subgruppe

Abstract

Um Einblicke in Untergruppen der heterogenen Spezies Malassezia pachydermatis zu gewinnen, wurden 205 von einheimischen Tieren stammende Wildisolate, die Referenzstämme CBS 1879 und 1892 und drei von Aizawa und Kano zur Verfügung gestellte Stämme des Typs B (2001) physiologisch-biochemisch und genetisch getestet. Im einzelnen wurde die Kulturmorphologie, die Catalase- und ß-Glukosidase-Aktivität, die Lipidassimilation (Tween 20, 40, 60, 80; Cremophor EL) und Kohlenhydratassimilation von neun Zuckern, Zuckeralkoholen und Säuren (Laktat, Saccharose, D-Glukose, L-Sorbose, Glycerol, D-Sorbitol, Succinat, D-Mannitol, Lactose) untersucht. An 114 Isolaten wurde die genetische Variabilität mittels RAPD (random amplified polymorphic DNA, Primer Rp-Malas-1) geprüft. Ferner wurde die insbesondere bei Malassezia furfur zu beobachtende Tryptophan-abhängige Synthese von Pigmenten und Fluorochromen (Mayser und Wille 1998) mit dem Ziel getestet, die pigmentbildende M. pachydermatis-Subgruppe (Mayser 2004) erstmalig physiologisch-biochemisch und genetisch näher zu charakterisieren. Einige Stoffe dieser Pigmente und Fluorochrome konnten bereits identifiziert werden (Mayser 2003, Irlinger 2005) und kommen als Pathogenitätsfaktoren bei Malassezia assoziierten Erkrankungen wie der Pityriasis versicolor in Frage (Krämer und Podobinska 2005, Krämer und Kessler 2005). Exemplarisch wurden Intensitätsunterschiede des gebildeten Pigments mittels Säulen- und Dünnschichtchromatographie (Mayser und Wille 1998) untersucht und die Ergebnisse in einen Zusammenhang mit der Pigmentbildung von M. furfur gestellt. Im Hinblick auf eine schnelle und zuverlässige Routinediagnostik zur Identifizierung von Pigmentbildnern wurde geprüft, ob Pigmentbildner ein charakteristisches insbesondere genetisches Profil aufweisen. Ein multivariates logistisches Regressionsmodell wurde angewandt, um Pigmentbildung anhand von physiologisch-biochemischen bzw. genetischen Parametern statistisch vorauszusagen. Zudem wurde die Frage beantwortet, ob M. pachydermatis-Pigmentbildner genetisch Typ B nach Aizawa und Kano zuzuordnen sind. Letztere hatten mittels RAPD und Sequenzierung des Chitin Synthase 2 (CHS 2) Gens diese genetisch M. furfur besonders nahe stehende Subgruppe gefunden. Die RAPD wurde nach der Methode von Aizawa und Kano (2001) durchgeführt. Alle getesteten Stämme waren Catalase und beta-Glukosidase aktiv. D-Glukose wurde wie Tween 40, 60 und 80 immer assimiliert, Glycerol, D-Mannitol, D-Sorbitol, Succinat, Tween 20 und Cremophor different (99; 46; 41; 2; 4; 66%). Neben Pigmentbildnern unterschiedlicher Intensität wurden Stämme ohne Pigment und unter letzteren Stämme mit weißer Ringbildung gefunden (40; 60; 42%). Die vergleichende Pigmentanalyse ergab eine große Ähnlichkeit der unterschiedlich intensiven Pigmente von M. pachydermatis. Gemeinsamkeiten mit M. furfur wurden deutlich. Neben dem für M. pachydermatis bereits nachgewiesenen Pityriacitrin (Mayser 2004) kommen auch Pityriarubine (Irlinger 2004) und Pityrialacton (Mayser 2003) als gemeinsame Pigmentbestandteile in Betracht. Sowohl die physiologisch-biochemischen als auch genetischen Ergebnisse zeigen eine hohe Heterogenität in der Spezies M. pachydermatis an: 25 verschiedene physiologisch-biochemische Profile und 28 Genotypen. Darüber hinaus weisen die physiologisch-biochemisch gefundenen Typen bei der RAPD Analyse mit dem Primer Rp-Malas-1 keine charakteristischen genetischen Profile auf. Die pigmentbildende Subgruppe konnte zum ersten Mal als heterogen beschrieben werden. Hier ließen sich acht physiologisch-biochemische und 14 genetische Typen (12 Cluster mit ausschließlich Pigmentbildnern sowie zwei Cluster sowohl mit Pigmentbildnern als auch Nicht-Pigmentbildnern) unterscheiden. Von letzteren konnte keiner Typ B zugeordnet werden. Damit konnte der Nachweis einer gemeinsamen Genetik von M. pachydermatis Pigmentbildnern und M. furfur, basierend auf ihrer gemeinsamen Stoffwechselleistung der Pigmentbildung, mit dieser Methode und diesem Primer nicht erfolgen. Ihre genetische Verwandtschaft kann aber weiterhin angenommen werden, auch könnte die pigmentbildende Subgruppe eine eigene Spezies innerhalb M. pachydermatis darstellen. Die beschriebene Heterogenität wird angesichts vier definierter Bandenbereiche (1083-989, 995-863, 860-751 und 430-369 bp), die Pigmentbildung statistisch vorhersagen (p< 0,001), relativiert. Die Methode der RAPD in Verbindung mit dem Primer Rp-Malas-1 und einem multivariaten logistischen Regressionsmodell ist damit interessant im Hinblick auf einen klinischen Test zur schnellen Ermittlung von Pigmentbildnern (wenige Stunden), zumal Pigmentbildung als Pathogenitätsfaktor in Frage kommt. Bislang wurde Pigmentbildung auf Tryptophan-haltigem Medium in einem Kulturverfahren nach 2-3 Wochen nachgewiesen (Mayser 2004). To gain insight into subgroups of the heterogeneous species Malassezia pachydermatis, 205 wild isolates from indigenous animals, the reference strains CBS 1879 and 1892 and three strains of Type B out of the collection of Aizawa and Kano (2001) were investigated. In detail, they were examined for culture morphology, catalase and ß-glucosidase activity, lipid assimilation (Tween 20, 40, 60, 80; Cremophor EL) and carbohydrate assimilation (lactate, sucrose, d-glucose, l-sorbose, glycerol, d-sorbitol, succinate, d-mannitol, lactose). Genetic variability was assessed on 114 strains by means of RAPD (random amplified polymorphic DNA, primer Rp-Malas-1). Furthermore, the tryptophan-dependent synthesis of pigments and fluorochromes, which is particularly observed with M. furfur (Mayser and Wille 1998), was tested with the aim of further characterizing pigment-producing M. pachydermatis strains (Mayser 2004) in terms of biochemistry, physiology and genetics. Some compounds of these pigments and fluorochromes could be already identified (Mayser 2003, Irlinger 2005) and may be a pathogenetic factor in Malassezia-associated diseases such as pityriasis versicolor (Krämer and Podobinska 2005, Krämer and Kessler 2005). Exemplarily, the varying intensity of pigment production was analyzed by means of column chromatography and thin-layer chromatography (Mayser and Wille 1998) and the results were compared to the pigment production of M. furfur. With regard to a quick and reliable clinical test for identification of pigment producers it was investigated whether pigment producers have a characteristic profile, in particular a genetic one. A multivariate logistic regression model was applied for statistical prediction of pigment production by the use of physiological-biochemical as well as genetic parameters. Finally, it was determined whether pigment-producing M. pachydermatis strains can be genetically assigned to Type B according to Aizawa and Kano. The latter identified this subgroup which is particularly close to M. furfur by means of RAPD and sequencing of the Chitin Synthase 2 (CHS 2) gene. RAPD was carried out according to the method of Aizawa and Kano (2001). All strains tested were active for catalase and ß-glucosidase. D-glucose as well as Tween 40, 60 and 80 were always assimilated, glycerol, d-mannitol, d-sorbitol, succinate, Tween 20 and Cremophor differently (99; 46; 41; 2; 4; 66%). Apart from pigment producers of varying intensity, strains devoid of pigment and among the latter those with white ring formation were found (40; 60; 42%). The comparative analysis of pigments showed a high similarity of differently intense pigments of M. pachydermatis. Besides, an analogy to M. furfur was demonstrated. Apart from pityriacitrin which was found already in M. pachydermatis (Mayser 2004), pityriarubins (Irlinger 2004) and pityrialacton (Mayser 2003) can also be considered as a common component of pigment production. Both, physiological-biochemical as well as genetic results indicate a high heterogeneity among the species M. pachydermatis: 25 different physiological-biochemical profiles and 28 genotypes. In addition, RAPD analyses of physiological-biochemical types do not show specific genetic profiles with primer Rp-Malas-1.The pigment-producing subgroup could be described for the first time as heterogeneous. Within it eight physiological-biochemical profiles and 14 genotypes (12 clusters with exclusively pigment producers and two clusters with both pigment and pigment non-producers) could be differentiated. Of the latter none could be assigned to Type B. Therefore, in spite of their common ability of pigment-production, common genetics of pigment-producing M. pachydermatis and M. furfur could not be demonstrated with this method and primer. However their genetic relatedness can be still assumed. Besides, pigment-producing isolates of M. pachydermatis might represent an independent species within M. pachydermatis.In spite of the reported heterogeneity, using four defined RAPD band areas as genetic variables (1083-989, 995-863, 860-751 and 430-369 bp), the occurrence of pigment formation was statistically predicted significantly (p< 0.001).These results demonstrate that the conjunction of RAPD with primer Rp-Malas-1 and a multivariate logistic regression model is interesting with regard to clinical tests for rapid determination of pigment producers (a few hours), as pigment production may be a pathogenetic factor. So far, results of the pigment test on tryptophan-containing medium are available only after 2-3 weeks of cultivation (Mayser 2004).