Real-time PCR applications in haemostasis and transfusion medicine

Abstract

This thesis deals with the development and application of novel real-time PCR assays in the field of haemostasis and transfusion medicine. Chapter 1 gives an general overview of real-time PCR and its current applications in haemotherapy. The development and validation of a real-time PCR assay for the detection of Parvovirus B19 DNA in blood donations is described in chapter 2. This sensitive and internally controlled PCR assay fulfils all criteria for the routine screening of predominantly B19 negative blood donations. A real-time PCR platform for the quantification of tissue factor (TF) mRNA in circulating blood monocytes is presented in chapter 3. To ensure reliable test results, a blood sampling system that includes a RNA stabilizing additive was evaluated. Utilizing the described TF real-time PCR assay we were able to demonstrate that desmopressin acetate (DDAVP) is able to induce monocytic tissue factor gene expression in vivo (chapter 4). By the application of different real-time PCR assays for absolute quantification of chosen marker transcripts, it was possible to validate the so-called SMART procedure for global amplification of platelet mRNA sequences applied for subsequent gene expression analysis (chapter 5). As described in chapter 6, different 5 -nuclease assays were used for the allelic discrimination of thrombophilic risk factors in patients with dural arteriovenous fistuals (DAVFs). In summary, the real-time 5 -nuclease assays described in this thesis showed to be valuable methods that strongly improved the possibilities of molecular analysis in haemostasis and transfusion medicine. In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung und Anwendung verschiedener Real-time PCR Verfahren im Bereich der Hämostaseologie und Transfusionsmedizin beschrieben. Kapitel 1 gibt hierbei eine allgemeine Einleitung in das Themengebiet und zeigt die momentan möglichen Anwendungen der Real-time PCR im Bereich der Hämotherapie auf. Eine in Kapitel 2 beschriebene Real-time PCR Methode zur quantitativen Detektion von Parvovirus B19 (B19) DNA erfüllt alle Voraussetzungen zur routinemäßigen Testung von Blutspendern und kann somit einen Beitrag zur Erhöhung der Sicherheit von Blutprodukten und Faktorenkonzentraten leisten. Während die zuverlässige Detektion viraler Nukleinsäuren in erster Linie von der Verfügbarkeit entsprechend konservierter Genombereiche abhängig ist, ist im Rahmen von Untersuchungen zur Gen-Expression verstärkte Aufmerksamkeit den präanalytischen Einflussfaktoren zu widmen. Diesem Umstand wurde bei der Entwicklung des in Kapitel 3 beschriebenen Testsystems zur absoluten Quantifizierung monozytärer Tissue Factor (TF) mRNA in Vollblut durch Verwendung eines kommerziellen RNA-Stabilisatorsystems Rechnung getragen. Mit der ebenfalls in Kapitel 3 beschriebenen TF Real-time RT-PCR konnte ein die monozytäre TF-Gen-Expression induzierender in-vivo Mechanismus von Desmopressin-Acetat (DDAVP) nachgewiesen werden (Kapitel 4). Kapitel 5 dieser Arbeit beschreibt die Evaluierung der sog. SMART-Methodik bezüglich der globalen Amplifikation revers-transkribierter mRNA zur globalen Gen-Expressionsanalyse individueller Thrombozytenpräparationen. Mit Hilfe der beschriebenen Real-time PCR Verfahren war es möglich, ausgewählte Transkripte über den globalen Amplifikationsvorgang hinweg zu quantifizieren, um Rahmenbedingungen zu definieren, welche den Erhalt des ursprünglich vorhandenen mRNA-Profils sicherstellen. In Kapitel 6 wird die Anwendung verschiedener Verfahren zur Allel-spezifischen Diskriminierung genetisch determinierter, thrombophiler Risikofaktoren beschrieben. Zusammenfassend belegen die in dieser Arbeit beschriebenen, neu entwickelten Real-time PCR Applikationen für die Indikationsgebiete Hämostaseologie und Transfusionsmedizin das breite Spektrum der Einsatzmöglichkeit dieser Methodik, das vom Mutationsscreening über die Infektionsdiagnostik bis zur Genexpressionsanalyse reicht.