Differentielle Expression von alpha-Aktinin Isoformen im Myokard von Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebeproben aus dem linken Ventrikel von Patienten mit terminaler Linksherzinsuffizienz infolge dilatativer Kardiomyopathie untersucht. Als Kontrollen dienten gesunde, nicht transplantierte Spenderherzen, sowie glattes Muskulaturgewebe aus der linken arteria thoracica interna. Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden wie PCR, Northern- und Western-Blot sowie der Immunhistochemie die Expression von verschiedene Isoformen des ubiquitär vorkommenden Proteins a-Aktinin in gesundem und an DCM erkranktemMyokard zu vergleichen. Untersuchungen mit dem konfokalen Mikroskop in der Immunhistochemie zeigten bei den Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie Akkumulationen des nicht sarkomerischen alpha-Aktinin-1 im sarkoplasmatischen Retikulum von Kardiomyocyten. Mit dem Western-Blot konnten wir die Resultate der immunhistologischen Untersuchungen lokal auf Proteinebene bestätigen. Sie zeigten, den Akkumulationen entsprechend, eine deutliche Überexpression der nicht sarkomerischen a-Aktinin-1 Isoform (AK: BM 75.2) in den Herzmuskelgeweben der an DCM erkrankten Patienten im Gegensatz zu denKontrollherzen. Auch die Kontrollen der glatten Muskulatur zeigten hier ein deutliches Signal, was für die Spezifität des Antikörpers spricht. Jedoch blieb eine entsprechende Bestätigung auf mRNA-Ebene, wie im Folgenden beschrieben, mit einer vergleichbaren Überexpression aus. Ähnlich verhielt es sich bei a-Aktinin-4 im Western-Blot. Zwar waren dezente Signalunterschiede zwischen Patientengeweben und Kontrollen zu erkennen, welche aber nicht als signifikant einzustufen waren. Die glatten Muskulatur-Kontrollen zeigten kein Signal. Der sarkomerische Antikörper (EA-53) produzierte, mit Ausnahme der Kontrollen für glatteMuskulatur, in allen Herzgeweben ein deutliches Signal. Zusammenfassend zeigte somit nur die nicht sarkomerische a-Aktinin-1 Isoform (AK: BM 75.2) ein unerwartetes aber spezifisches und richtungweisendes Signal als Hinweis eines defekten Proteinmetabolismus. Unter den Northern-Blot-Analysen zeigten die cDNA Sonden für a-Aktinin-1 und 2 die erwarteten 3,5 kb großen isoformenspezifische Signale, die jedoch keine Differenzen zwischen Kontrollherzen und DCM-Patienten aufwiesen.a-Aktinin -3 und 4 konnten mit den cDNA Sonden als auch später mit den spezifischen Oligonukleotiden nicht detektiert werden. Confocal microscopic studies in human explanted hearts with DCM showed an accumulation of non-sarcomeric a-actinin (ACTN1) in the sarcoplasmic reticulum of cardiomyocytes. To analyse this phenomenon in more detail, specific oligonucleotides for ACTN-1(smooth muscle), ACTN-2 (cardiac), ACTN-3 (skeletal) and ACTN-4 (non muscle) were used for Northern-Blot analysis in conjunction with isoform specific antibodies in Western-Blot (non-sarcomeric antibody BM 75.2, sarcomeric antibody EA 53, non-muscle antibody NCC-LU-632). Furthermore we performed PCR sequencing to verify the used oligonucleotides. We analysed 17 tissue samples from DCM and 4 control hearts. In Western-Blot analysis we could confirm the results from the immunhistochemical studies.The non-sarcomeric antibody (BM 75.2) showed a significant overexpression of ACNT-1 in patients with DCM, comparing with the control hearts. The two other antibodies (EA-53 / NCC-LU-632) showed the expected signals without any significant differences between the compared tissues, whereas the smooth muscle controls (left intern thoracic artery) showed no signal by using the non-sarcomeric antibody. In Northern-Blot analysis ACTN3 and 4 were not detected, neither by cDNA probes, nor by oligonucleotides. ACTN-1 and ACTN2 was detected by the cDNA probes at 3,5 kb without any visible differences between control and DCM. Because of the unusual results in the immunhistochemical studies we used three different specific oligonucleotides for ACTN1. By hybridisation with these oligonucleotides we detected furthermore a previously unknown 1.9kb mRNA in addition to the expected 3.5 kb mRNA with all oligonucleotides. However, sequencing of PCR products, generated by the same oligonucleotides, identified only ACTN1 and ACNT-1 similar proteins.Conclusion: Overexpression of an unusual a-actinin isoform is typical of hearts with DCM. Intracellular accumulation might represent disturbed protein metabolism leading to cellular dysfunction and heart failure.