Molekulare Interaktion von Lidocain mit dem isolierten tetrodotoxinresistenten Natriumkanal vom Typ NaV1.8 exprimiert in humanen embryonalen Nierenstammzellen HEK293

Abstract

Natriumkanäle in Nervenzellmembranen sind wesentlich an der Erregungsbildung und -weiterleitung im peripheren Nervensystem beteiligt. Bestimmte tetrodotoxinresistente (TTX-R) Subtypen scheinen in der Entstehung des neuropathischen und chronischen Schmerzes eine bedeutende Rolle zu spielen. Therapeutika dieser Schmerzzustände zeigen oft eine deutliche Wirkung auf Natriumkanäle, grundlegende Interaktionen dieser Substanzen mit TTX-R Natriumkanälen sind jedoch nicht gut untersucht. Thema dieser Arbeit ist es daher die Interaktionen des klassischen Natriumkanalblockers Lidocain mit dem tetrodotoxinresistenten Natriumkanal vom Typ Nav1.8 zu untersuchen.Um den Einfluß des Pharmakons ohne Beeinflussung durch andere physiologischerweise vorkommende Ionenkanäle studieren zu können, wurden diese Kanäle isoliert in HEK293-Zellen exprimiert und mit der Whole-cell Patch-clamp-Methode untersucht. Die Lidocainblockade zeigte sich auch in diesen Versuchen als konzentrationsabhängig und reversibel. Bei repetitiver Reizung konnte eine phasische oder use-dependent -Blockierung beobachtet werden, also eine mit der Reizanzahl zunehmende Blockierung. Die tonische und phasische Blockade zeigt sich abhängig vom zuvor herrschenden Membranpotential; mit zunehmender Depolarisation sinken die zur Blockade der Hälfte aller Natriumkanäle (IC50) notwendigen Lidocainkonzentrationen. Die IC50-Werte der phasischen Blockade nähern sich mit zunehmender Depolarisation denen der tonischen Blockade an. Die Blockade des isolierten Natriumkanals vom Typ Nav1.8 mit Lidocain zeigte eine Zunahme der Blockierung im Zeitverlauf nach Reizung und Kanalöffnung. Dieser dynamische Block entsteht durch eine deutliche Zunahme der Affinitäten zu Lidocain des geöffneten gegenüber dem ruhenden Kanal. Die IC50-Werte liegen für den geöffneten Kanal liegt bei 46,4 ± 10,8 µmol/l, für den ruhenden Kanal bei 2247 ± 628 µmol/l. Die Untersuchungen dienten zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten der Hin- und Rückreaktion der Lidocainbindung an den Lokalanästhetikarezeptor im Innern der Kanalpore. Die Hinreaktion verläuft als Reaktion 1. Ordnung mit 1,36 · 106 l mol-1 8 -1. Die Konstante der Trennung des Lidocains vom Natriumkanal beträgt hier 197 s -1. Die Refraktärzeit und Reaktivierung unter Lidocainwirkung zeigt eine Zunahme der langsamen Komponente der Inaktivierung. Es kommt zu einer Verlängerung der Erholungszeit von der Inaktivierung. Nav1.8-Kanäle zeigen zwei Aktivitätszustände mit fundamental verschiedenen Affinitäten gegenüber Lidocain: Im Ruhezustand findet sich eine niedrige, eine hohe Affinität dagegen während der Kanalöffnung. Der spannungsabhängige Prozess der Kanalöffnung selbst ist verantwortlich für die Änderung der Affinität gegenüber Lokalanästhetika und somit Grundlage einer statusabhängigen Blockierung des Kanals und der dynamischen Blockade während der Depolarisation. Der Inaktivierungsprozess, etwa die Bindung des Inaktivierungspartikels, beeinflusst die Affinität des Kanals dagegen nicht, sondern fängt das Lidocainmolekül in der Kanalpore. Resultat ist ein ausgeprägter use-dependent -Block. Sodium channels in neuronal membranes are necessary for excitation and signaltransduction. Channels resistant to tetrodotoxin (TTX-R) appear to play a crucial part in pathogenesis of chronic and neuropathic pain syndromes. Severaldrugs empirically used in the treatment of those syndromes are known as sodiumchannel blockers, basic interactions of these drugs and TTX-R channels are notyet examined. This study shows the interaction of the classical sodium channelblocker lidocaine with the TTX-R sodium channel type Nav1.8. To examine the influence of the drug without interference with other physiologic ion channels, cloned and in HEK293-cells expressed Nav1.8 were used. For experiments, we used the patch-clamp method in the whole-cell configuration.Coherent to earlier studies with native dorsal root ganglia cells, the lidocaineblock of sodium channel Nav1.8 showed concentration-dependance and full reversibility. During repetitive stimulation I found an increase of blockade over time,called use-dependent block. Tonic and use-dependent block are influenced bythe resting membrane potential: In a highly depolarized state, the half-maximalblocking concentrations (IC50) of both tonic and use-dependent block are significantly lower, and moreover, close together compared to the hyperpolarized state. Lidocaine showed an increase of blockade of sodium channel Nav1.8 during channel opening after excitation. This dynamic block develops through altered affinities with lidocaine in resting versus open state. In open state we found an IC50 of 46.4 ± 10.8 μmol/l, compared to resting state IC50 of 2247 ± 628 μmol/l. The rate constant for binding of lidocaine to its binding site on the sodium channel was concentration dependent 1.36 · 106 l mol−1s−1. Unbinding of lidocaine was found to be 197 s−1. Lidocaine altered the time courses of the absolute refractory period and reactivation, respectively. The slow component of inactivation was increased, while the reactivation was slower. Nav1.8 channels exhibit two major affinity states to local anesthetics, a low affinity state at rest and a high affinity state during activation. It appears that the voltage dependent activation process itself modulates the channel s affinity to the drug and thus is essential for state dependent block, resulting in dynamic block during the depolarization. The fast inactivated channel may be viewed as an activated but intrinsically blocked channel. The inactivation process itself, i.e. binding of the inactivation particle, does not modulate the affinity, but rather traps charged drug molecules in the pore giving strong use-dependent block.