Tryptophan-abhängige Pigmentbildung bei Ustilago maydis sowie der Mutante UV31 im Vergleich zu Malassezia furfur

Abstract

Im Jahr 2000 konnte in Untersuchungen von Begerow und Bauer die phylogenetische Verwandtschaft des humanpathogenen M. furfur zu den phytopathogenen Brandpilzen festgestellt werden. Um die Verwandtschaft näher zu untersuchen und gegebenenfalls Informationen über den evolutionsgeschichtlichen Hintergrund von M. furfur zu gewinnen, wurde der am weitesten erforschte Brandpilz U. maydis in dieser Arbeit näher untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass U. maydis unter Gabe von TRP als alleiniger Stickstoffquelle auch ein braunes Pigment produziert. Dieses Phänomen war erstmals bei M. furfur beschrieben worden. Die genauere Untersuchung des Rohextraktes erbrachte den Nachweis der ebenfalls bei M. furfur unter den gleichen Bedingungen erstmalig entdeckten Indolderivate Pityriarubin B, Pityriarubin C, Malasseziaindol A, Pityriaanhydrid sowie den UV-Filter Pityriacitrin. Die Funktion des Pityriacitrins konnte bei M. furfur schon mehrfach von Mayser et al (1998, 2002, 2003) nachgewiesen werden. Daher erfolgte auch eine Untersuchung des bei U. maydis gewonnenen Pityriacitrin-haltigen Rohextraktes. In mehreren Versuchen mit verschiedenen einmaligen UV-A (100 J/cm², 200 J/cm²) und UV-B (500 mJ/cm², 1000 mJ/cm², 2000 mJ/cm²) Expositionen konnte gezeigt werden, dass U. maydis, der mit TRP angezüchtet worden war, wesentlich strahlenunempfindlicher war, als mit ARG angezüchtete U. maydis Kulturen. Dies galt insbesondere für die Betrahlungen mit UV-A 100 J/cm² (absolut p=0,108; relativ p=0,09) sowie UV-B 500 mJ/cm² (absolut p=0,01; relativ p=0,002) und 1000 mJ/cm² (absolut p=0,993; relativ p=0,003). Bei Bestrahlungen mit UV-A 200 J/cm² sowie UV-B 2000 mJ/cm² kam es sowohl bei mit TRP als auch mit ARG angezüchteten U. maydis Kulturen zu keinerlei Wachstum. Desweiteren wurde eine Mutante (UV31) des U. maydis Wildtypes untersucht, die unter Gabe von TRP als alleiniger Stickstoffquelle nur sehr wenig Pigment produzierte. Die Untersuchung des Rohextraktes zeigte dann, dass das Pityriacitrin verstärkt produziert wurde, wohingegen die Pityriarubine sowie das Pityriaanhydrid nicht nachweisbar waren. Damit ist davon auszugehen, dass ein für den TRP-abhängigen Sekundärmetabolismus wichtiges Gen bei der Mutante getroffen wurde. Die Bedeutung des UV-Schutzes könnte durch starke UV-Exposition und damit erhöhtem Bedarf an UV-protektiven Maßnahmen im Laufe der Evolution bedingt sein. Dem UV-Schutz scheint dabei eine essentielle Rolle zuzukommen, wie auch die vermehrte Produktion in UV31 zeigt. Außerdem wird eine Funktion der gebildeten Substanzen als Schutz vor oxidativem Stress angesehen, ähnlich den Flavonoiden und Carotinoiden bei den Pflanzen, wobei bereits von Kim et al. 2001 eine Aktivitätssteigerung der Phenylalanin ammino-lyse (PAL) durch TRP bei U. maydis und einigen anderen ihm verwandten Pilzen gezeigt werden konnte. Von Pflanzen ist bekannt, dass dadurch ein Sekundärmetabolismus induziert werden kann, aus dem die Flavonoide hervorgehen, die einen Schutz vor oxidativem Stress bieten. Bei Pilzen wie U. maydis und M. furfur könnte es sich um einen ähnlichen Vorgang handeln, bei dem andere Substanzen, wie eben die Pityriarubine und das Pityriacitrin, diese Aufgabe erfüllen. In the year of 2000, genetic examinations of Begerow and Bauer showed the relationship between the human pathogenic M. furfur and the phytopathogenic Ustilaginomycetes. To get more information about the relationship and possibly about the evolutionary backround of M. furfur, the most explored fungus of the Ustilagomycetes (U. maydis) was examined in this project. It was possible to show that U. maydis started producing a brown pigment when it was grown with TRP as the single nitrogen source. This phenomenon was seen first in M. furfur. The closer examination of the crude extract showed that there were some substances (piyriarubin B, pityriarubin C, malasseziaindole A, pityriaanhydride and the UV-filter pityriacitrin) included, that were discovered first in M. furfur under the same circumstances. The function of pityriacitrin was already shown several times by Mayser et al. (1998, 2002, 2003). In this project there was an examination of the UV-protective function of the crude extract that was found in U. maydis, most likely caused by pityriacitrin. Therefore, there were several experiments with UV-A (100 J/cm², 200 J/cm²) and UV-B (500 mJ/cm², 1000 mJ/cm², 2000 mJ/cm²) exposure. It was possible to show that U. maydis which was grown with TRP had a higher resistance against UV-light than U. maydis which was grown with ARG. This was shown especially under exposure with UV-A 100 J/cm² (total p=0,108; percentage p=0,09) as well as UV-B 500 mJ/cm² (total p=0,01; percentage p=0,002) and 1000 mJ/cm² (total p=0,993; percentage p=0,003). No cultures were growing under exposure with UV-A 200 J/cm² and UV-B 2000 mJ/cm². Furthermore the mutant UV31 was examined because it produced almost no pigment with TRP as the single nitrogen source. To get the same amount of crude extract as in U. maydis there were much more cultures necessary. The examination of the crude extract showed that there was a higher production of pityriacitrin while there were no traces of the pityriarubins and the pityriaanhydride. Most likely a gene which is important for the TRP-depending secondary metabolism was involved in the genetic change. The importance of the UV-protection could be caused by high UV-exposure and increased need in UV-protective solutions during evolution. The UV-protection seems to play an essential role as shown in the increased production of pityriacitrin in UV31. A function of the produced substances as a protection against oxidative stress, just like the flavonoids and carotinoids in plants, is being discussed as well. Kim et al (2001) were able to show a TRP-depending increase of the phenylalanin ammonia-lyase (PAL) activity in U. maydis and some other related fungi. It is known from plants that the PAL can induce a secondary metabolism with the production of flavonoids which can protect against oxidative stress. Possibly U. maydis and M. furfur are having a similar mechanism in which the pityriarubins and the pityriacitrin are fulfilling this function.