Elektrophysiologische Charakterisierung der durch alpha-Hämolysin von Escherichia coli induzierten Membranporen in humanen embryonalen Nierenzellen

Abstract

Alpha-Haemolysin (alpha-Hly), ein porenbildendes Toxin aus der Gruppe der RTX-Toxine, ist ein essentieller Virulenzfaktor des humanpathogenen, gramnegativen Bakteriums Escherichia coli. Es kann lebensbedrohliche Infektionen wie Cholezystitis, hämorrhagische Kolitis, hämolytisch-urämisches Syndrom, Sepsis und Meningitis verursachen. Auf zellulärer Ebene zeigt alpha-Hly ein breites Spektrum von Wirkungen auf Blut- und Körperzellen. Es verändert die Genexpression sublytisch betroffener Zellen, induziert unter anderem so die Bildung und Freisetzung von Entzündungsmediatoren, verursacht Apoptose oder Nekrose und führt in hohen Konzentrationen zur Lyse der Zellen. In der vorliegenden Arbeit konnten zum Teil erstmalig mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik grundlegende Eigenschaften der Porenbildung durch alpha-Hly an Zellmembranen kernhaltiger Zellen beobachtet und analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Applikation von alpha-Hly auf HEK293-Zellen innerhalb einer, verglichen mit anderen Toxinen, auffallend kurzen Latenzzeit zur Porenbildung kommt. Die Porenbildung durch alpha-Hly war transienter Natur und die Poren wechselten zwischen geöffneten und geschlossenen Zuständen. Die Porenöffnungen und -schlüsse erfolgten schlagartig, schnell und betrugen weniger als 10 ms. Es konnte eine elementare Grundpore mit einer Leitfähigkeit von 150 pS identifiziert werden. Die Beobachtungen lassen die Vermutung zu, dass alpha-Hly in der Zellmembran Porencluster bildet, die sich synchron öffnen und schließen können. Die durch alpha-Hly induzierten Poren waren unselektiv permeabel zumindest für monovalente Kationen wie Kalium und Natrium. Weiterhin konnte erstmals elektrophysiologisch gezeigt werden, dass auch Ca2+ durch die alpha-Hly-Poren in die Zellen gelangen kann. Die porenbildende Wirkung von alpha-Hly war von der extrazellulären Anwesenheit von Ca2+ abhängig, wobei Ca2+ durch Sr2+ und Ba2+ substituiert werden konnte. Physiologische Faktoren wie Temperatur oder pH-Wert der Extrazellulärlösung hatten einen starken Einfluss auf die porenbildende Wirkung von alpha-Hly. Die Temperatursenkung und der Ausgleich einer metabolischen Alkalose scheinen daher effektive Maßnahmen in der Therapie generalisierter E.coli-Infekte zu sein. Alpha-Hemolysin (alpha-Hly), a pore-forming Toxine of the RTX-Family, is an essential virulence factor of the humanpathogen, Gram-negative bacterium Escherichia coli. It causes life-threatening infections such as cholecystitis, hemolytic-uraemic syndrome, sepsis and meningitis. On the cellular level alpha-Hly displays a wide range of effects on red blood and systemic cells, modifies the genexpression of sublytically affected cells, induces the production and the release of inflammatoric mediators, causes apoptosis or necrosis and leads in higher concentrations to lysis of the cells.Partly for the first time we observed and analysed in the present work by means of Patch-Clamp-Technique elementary features of the pore-formation via alpha-Hly within the cell membrane of nucleated target cells. Compared to other toxines alpha-Hly-induced pore-formation occurred with a striking short latency after toxin application. Pore-formation by alpha-Hly was transient and the pores switched between open and closed states. Pore opening and closing were very fast and took less than 10 ms. An elementary pore with the conductance of 150 pS was identified. From our data it may be presumed, that alpha-Hly formes pore-clusters which are able to open and close synchronously. The alpha-Hly-pores were non selec-tively permeable at least for monovalent cations such as potassium and sodium. Furthermore it was shown for the first time electrophysiologically that even Ca2+ passes through the pores into the cells. The pore-forming effect of alpha-Hly de-pended on the presence of a extracellular Ca2+, whereas Ca2+ could be substituted with Ba2+ or Sr2+. Physiological factors such as temperature and the pH-value of the extracellular solution had a strong influence on the pore-forming effect of alpha-Hly. The decrease of the temperature and the adjustment of a metabolic alkalosis seem to be effective tools in the therapy of a generalized E.coli-infect.