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dc.contributor.authorSevilla Pérez, Julia
dc.date.accessioned2023-03-16T20:04:00Z
dc.date.available2008-06-04T08:13:18Z
dc.date.available2023-03-16T20:04:00Z
dc.date.issued2007
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-59319
dc.identifier.urihttps://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/13913
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.22029/jlupub-13295
dc.description.abstractLung function is critically dependent on the integrity of the pulmonary epithelial cell layer, which is largely comprised of bronchial, Clara, and type I and II alveolar epithelial cells (AEC). While primary AEC culture has increased our knowledge of AEC gene expression in vitro, a comprehensive analysis of epithelial cell gene transcription in vivo has not yet been attempted. Therefore, we sought to profile the epithelial cell gene expression in the murine lung in vivo. We established a method to obtain epithelial cell RNA-enriched fractions using a diluted guanidinium isothiocyanate solution, administered intratracheally. After lavaging the lungs twice with saline, the optimal dilution and retention time were optimised. This resulted in an enriched epithelial cell RNA fraction with low contamination by RNA from fibroblasts, smooth muscle, or endothelial cells, as assessed by marker gene expression. This novel methodology, named as epithelial lavage (EL), thus allows for the selective profiling of lung epithelial-specific gene expression patterns in vivo. Furthermore, in order to mimic the high levels of transforming growth factor beta 1 (TGF-beta1), a cytokine expression of which is dramatically upregulated in the lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), the recombinant TGF-beta1 was instilled into the murine lung. It was demonstrated that the orotracheal (OT) administration of TGF-beta1 stimulated Smad-dependent signalling in pulmonary epithelial cells, and induced transcription of TGF-beta1-responsive genes. The activation of the downstream signalling pathway, assessed by Western blotting, microarray, and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), was achieved within short stimulation time-points and with either low or high concentrations of TGF-beta1. TGF-beta1-induced gene transcription was studied in the lung in vivo after OT administration of TGF-beta1 in combination with the EL methodology. A single dose of TGF-beta1 stimulated the regulation in expression of some markers after 8 h, as assessed by quantitative RT-PCR. Therefore, TGF-beta1 induction of gene expression on the epithelium was demonstrated in vivo. Therefore the EL represents a novel methodology to isolate RNA from the lung epithelium and study the gene expression profile of these cells under different conditions, like the TGF-beta1 effect assessed in this study.en
dc.description.abstractDie Funktion der Lunge hängt wesentlich von der Intaktheit der Epithelschicht ab, welche hauptsächlich aus Bronchialzellen als auch aus Clarazellen und TypI und TypII Pneumocyten, den Alveolarepithelzellen, besteht. Während mit Hilfe der Zellkultur von primären Zellen bereits viel über die Genexpression in Pneumocyten in vitro erforscht werden konnte, wurde bisher noch keine weitergehende Studie über die Genexpression im Lungenepithel in vivo durchgeführt. Deshalb haben wir in unserer Studie die Genexpression von Epithelzellen der Mauslunge in vivo untersucht. Wir etablierten eine Methode, bei der RNA-Fraktionen aus dem Lungenepithel gewonnen werden, indem verdünntes Guanidinisothiocyanat intratracheal in die Mauslunge appliziert wird. Nachdem die Lunge zwei mal mit Salzlösung gespült worden war, wurden die Verdünnung und die Verweilzeit der Lösung in der Lunge optimiert. Dadurch erhielten wir eine Fraktion, die mit epithelialer RNA angereichert war, mit geringer Kontamination durch RNA von Fibroblasten, glatten Muskelzellen oder Endothelzellen. Dies zeigten wir durch die Untersuchung der Expression von Markergenen. Diese neue Methode, Epitheliale Lavage (EL) genannt, ermöglicht also eine selektive Darstellung der Expressionen von lungenepithelspezifischen Genen in vivo.Um die hohen Konzentrationen des transforming growth factor beta 1 (TGF-beta1) zu imitieren, einem Zytokin, dessen Expression in der Lunge von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF, Idiopathic Pulmonary Fibrosis) stark hochreguliert ist, wurde TGF-beta1 als rekombinantes Protein in die Mauslunge instilliert. Dadurch konnte gezeigt werden, dass eine oro-tracheale Administration von TGF-beta1 den intrazellulären Smad-abhängigen Signaltransduktionsweg in den Lungenepithelzellen stimuliert, sowie die Expression der Gene, die durch TGF-beta1 aktiviert werden. Die Aktivierung der nachgeschalteten Signalwege wurde bereits nach kurzer Stimulationszeit sowie mit niedrigen und hohen Konzentrationen des Liganden TGF-beta1 durch Westernblot, Microarray und semi-quantitativen RT-PCR nachgewiesen. Wir untersuchten die TGF-beta1-induzierte Gentranskription in der Lunge in vivo nach orotrachealer Applikation von TGF-beta1 in die Lunge in Kombination mit der epithelialen Lavage-Technik. Acht Stunden nach einer einmaligen Gabe von TGF-beta1 konnten wir mit Hilfe der quantitativen RT-PCR einen Effekt auf die Regulation der Expression einiger Marker feststellen. Dadurch konnten wir die TGF-beta1-regulierte Induktion der Genexpression im Lungenepithel in vivo zeigen. Aufgrund unserer Ergebnisse konnten wir zeigen, dass EL eine neue Methode darstellt, RNA aus dem Lungenepithel zu isolieren und das Genexpressionsprofil dieser Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, wie der Effekt von TGF-beta1 in der vorliegenden Studie.de_DE
dc.language.isoende_DE
dc.rightsIn Copyright*
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/page/InC/1.0/*
dc.subjectTGF-beta1de_DE
dc.subjectLungenepithelzellende_DE
dc.subjectGenexpressionde_DE
dc.subjectin vivode_DE
dc.subjectLungede_DE
dc.subjectalveolar epithelial cellsen
dc.subjectgene expressionen
dc.subjectin vivoen
dc.subjectlungen
dc.subjectTGF-beta1en
dc.subject.ddcddc:570de_DE
dc.titleAlveolar epithelial cell-specific gene expression in vivo : effect of TGF-beta1 stimulationen
dc.title.alternativeStudie der Genexpression der Lungenepithelzellen in vivo : TGF-beta1 Induktionde_DE
dc.typedoctoralThesisde_DE
dcterms.dateAccepted2008-04-16
local.affiliationFB 11 - Medizinde_DE
thesis.levelthesis.doctoralde_DE
local.opus.id5931
local.opus.instituteFaculty of Internal Medicine (Human Biology)de_DE
local.opus.fachgebietMedizinde_DE


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