Differenzierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Untersuchung der Spezifität des ROS-Fluoreszenzindikators H2R bei PC12-Zellen der Ratte unter Hypoxie

Abstract

Der O2-messende Mechanismus chemosensitiver Paraganglien von Säugetieren ist nach wie vor nicht vollständig aufgeklärt. Als Modell für Studien am O2-messenden Mechanismus Hypoxie-sensitiver Paraganglien dienten PC12-Zellen, da sie eine sehr hohe Sensitivität gegenüber O2-Schwankungen aufweisen. In Versuchen an PC12-Zellen konnte unter Hypoxie ein intrazellulärer Anstieg von ROS beobachtet werden. In den bisherigen Arbeiten wurde bisher jedoch noch nicht untersucht, welche ROS genau gebildet werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu ermitteln, welche ROS unter Hypoxie in PC12-Zellen der Ratte gebildet werden, ebenfalls wurde die Spezifität des Fluoreszenz-indikators H2R für die ROS-Untersuchung untersucht. Zur genaueren Differenzierung der ROS wurden verschiedene Radikalfänger und Inhibitoren der ROS-Bildung eingesetzt. Die PC12-Zellen wurden in Gegenwart von H2R unter Normoxie und Hypoxie inkubiert. Durch intrazellulär gebildete ROS wird die farblose Substanz zu ihrem fluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 oxidiert. Mittels Laser Scan Mikroskop konnte die Fluoreszenzintensität des Indikators gemessen werden. In 35 Messungen ohne Inhibitor- oder Radikalfängerzusatz konnte ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität unter hypoxischen Bedingungen beobachtet werden. Um herauszufinden, ob extrazelluläres H2O2 bei der H2R-Oxidation beteiligt ist, wurde Katalase eingesetzt. Die Messergebnisse von mit Katalase-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollen wiesen nach Inkubation unter normoxischen und hypoxischen Konditionen keinen signifikanten Unterschied auf. Cysteamin wurde als intrazellulärer H2O2-Fänger eingesetzt. Die Messergebnisse von Cysteamin-behandelten Zellen und Kontrollen wiesen nach Inkubation unter Normoxie keinen signifikanten Unterschied auf, jedoch konnte unter hypoxischen Bedingungen ein signifikant geringerer Fluoreszenzanstieg in Cysteamin-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt werden. Phenanthrolin wurde als Eisenchelator eingesetzt. Im Vergleich zu Kontrollen wiesen Phenanthrolin-behandelte Zellen nach Inkubation unter normoxischen und hypoxischen Konditionen keinen signifikanten Unterschied in der Rhodamin 123-Fluoreszenzintensität auf. Dimethylharnstoff wurde als Hydroxylradikal-Fänger eingesetzt. Auch die Mess-ergebnisse von Dimethylharnstoff-behandelten Zellen und Kontrollen wiesen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie keine signifikanten Unterschiede auf. Um zu überprüfen, in wie weit NO˙ oder ONOO- in diesem Versuchsaufbau bei der H2R-Umwandlung eine Rolle spielen, wurden Versuche mit Ebselen (Antioxidanz, welches an Peroxynitrit bindet) und N-G-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA, NO-Synthasehemmer) durchgeführt. Sowohl die Messergebnisse an Ebselen-behandelten PC12-Zellen als auch die an L-NMMA-behandelten Zellen wiesen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf. Nitroblautetrazolium (NBT) wurde schließlich als intrazellulärer O2.--Fänger eingesetzt. Die Messergebnisse von NBT-behandelten Zellen wiesen im Vergleich zu Kontrollen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie signifikant geringere Werte auf. In NBT-behandelten Zellen führte Hypoxie nicht mehr zu einem siginifikanten Anstieg der Indikatorfluoreszenz. The O2-sensor mechanism of mammalian chemosensitive paraganglia is still not fully understood. A tumour cell line (PC12-cells) derived from the rat adrenal medulla is highly sensitive to changes in pO2 and, therefore often utilized to serve as model to investigate this O2-sensor mechanism. In PC12-cells, an intracellular increase of reactive oxygen species (ROS) has been observed during hypoxia, but it is still unknown, which specific ROS is produced. The aim of the present study was to investigate which particular ROS are produced during hypoxia in rat PC12-cells. In addition, the specificity of the redox-sensitive indicator dihydrorhodamine 123 (H2R) for the detection of ROS was investigated. PC12-cells were exposed to H2R during normoxia and hypoxia. This non-fluorescent dye is oxidized by intracellular ROS to its fluorescent metabolite rhodamine 123. Fluorescence was measured by laser scanning microscopy. Several radical-scavengers and inhibitors of ROS-generation were used for ROS-differentiation. Catalase was used to determine the involvement of extracellular H2O2 in H2R-oxidation. Cysteamine served as an intracellular H2O2-scavenger. 1,10-Phenanthroline was utilized as an iron-metal chelator, which blocks the hydroxyl radical generation. Dimethylthiourea was used as a scavenger of hydroxyl radicals. Ebselen is a scavenger of peroxynitrite. The NOS inhibitor NG-monomethyl-L-arginine acetate (L-NMMA) was used to inhibit NO-production. Nitro blue tetrazolium (NBT) is a scavenger of superoxide anions. In all 35 experiments without inhibitor or scavenger additives, a significantly increased fluorescence intensity was observed when PC12-cells were exposed to hypoxia. Treatment of PC12-cells with catalse, 1,10-Phenanthroline, dimethylthiourea, ebselen and L-NMMA had no significant impact upon normoxic and hypoxic H2R-oxidation. The results obtained from PC12-cells after incubation with cysteamine showed slight reduction in the hypoxia-induced increase in fluorescence indicator intensity wheras normoxic fluorescence intensity remained unaffected. In contrast NBT caused a significant reduction in fluorescence intensity during hypoxia and normoxia, and fully prevented a hypoxia-induced increase in fluorescence.