Gewinnung und elektrophysiologische Charakterisierung von Listeriolysin O-haltigen Überständen aus Bakterienkulturen von Listeria monocytogenes und ihrer Mutanten
| dc.contributor.author | Kaschinski, Stanislav | |
| dc.date.accessioned | 2023-03-16T20:04:23Z | |
| dc.date.available | 2008-10-13T11:53:59Z | |
| dc.date.available | 2023-03-16T20:04:23Z | |
| dc.date.issued | 2008 | |
| dc.identifier.uri | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-64722 | |
| dc.identifier.uri | https://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/13964 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-13346 | |
| dc.description.abstract | Das Peptid Listeriolysin O (Mr=58 kD) ist der wichtigste Virulenzfaktor von L. monocytogenes.Es ist eines von 23 Mitgliedern aus der Familie der cholesterolabhängigenund thiolaktivierbaren Zytolysine (CDTXs, cholesterol-dependent toxins).Neben der Modulation verschiedener zellulärer Signalkaskaden weist das ToxinListeriolysin O eine an lebenden, eukaryontischen Zellen elektrophysiologisch messbareporeninduzierende Wirkung auf. Die Porenbildung in der eukaryontischen Zellmembranspielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenität von L. monocytogenes. Zunächst wurde eine Methode etabliert, mit der sich die für die elektrophysiologischenMessungen notwendigen Toxinmengen schnell, einfach und reproduzierbargewinnen ließen. Mit Hilfe des herausgearbeiteten Isolationsprotokolls wurdedie poreninduzierende Kinetik von zwei Listeriolysin O-DNA-Mutanten aus L. monocytogeneshlyW492A- und L. monocytogenes hlyC484S-Bakterienkulturen, vondenen bis zu diesem Zeitpunkt keine gereinigten Toxinformen existierten, gewonnenund elektrophysiologisch charakterisiert. Erstmalig konnte eindrucksvoll eineSteigerung der poreninduzierenden Bildung von LLO mit Steigerung der Temperatur(Q10-Wert von 3-4) demonstriert werden. Die nicht poreninduzierende LLO-DNAMutante hlyW492A zeigte auch bei einer Messtemperatur von 37°C keinePoreninduktion. Für die LLO-DNA-Mutante hlyC484S konnte gezeigt werden, dassdiese Toxinform eine bis um den Faktor 10 höhere poreninduzierende Potenzaufweist als LLO-WT. Diese Untersuchungen veranschaulichten die große Rolle deseinzigen Cysteinrests in der Primärstruktur des LLO-Moleküls, die in der Literatur alsThiolaktivierung bekannt ist. Für das thiolhaltige Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) konnte gezeigt werden,dass es die poreninduzierende Potenz von LLO um den Faktor 3,5 steigert. Ebenfallskonnte eine Steigerung der porenbildenden Potenz von LLO durch den thiolhaltigenACE-Hemmer Captopril demonstriert werden. Überraschenderweise wurde Protamin,eine weitere thiolhaltige Substanz, als Blocker der LLO-induzierten Poren identifiziert.Für Protamin konnte erstmalig elektrophysiologisch gezeigt werden, dass dieseSubstanz eine eigene poreninduzierende Wirkung aufweist und dass dieser Effektstark vom Membranhaltepotential der Zelle abhängt. | de_DE |
| dc.description.abstract | The peptide toxin listeriolysin O (LLO; Mw = 58 kDa) is an essential virulence factorof the gram-positive, facultative intracellular bacterium L. monocytogenes. It is one of23 members of the family of cholesterol-dependent and thiol-activated cytolysins (=CDTXs, cholesterol-dependent toxins). Further to its ability to modulate variouscellular signalling events, LLO forms pores in the plasma membrane of viableeukaryotic cells, which can be detected electrophysiologically. The pore formingability of LLO plays a key role in the pathogenicity of L. monocytogenes. The present work established a method that allows rapid, easy and reproduciblepreparation of LLO amounts sufficient for a number of electrophysiologicalmeasurements. Due to this preparation method it became possible to characterizethe kinetics of pore formation and further properties of two LLO mutants from L.monocytogenes hlyW492A and hlyC484S, which were not available as purifiedtoxins. For the first time it was demonstrated that the pore formation by LLO stronglydepends on temperature and is significantly increased at physiological bodytemperature compared to room temperature. In contrast, no increase in pore-formingactivity by elevation of the temperature to 37 °C was observed for the LLO mutanthlyW492A, which already has a strongly reduced pore forming potency at roomtemperature, compared to wild-type LLO. On the other hand, an about tenfoldincrease in pore forming activity compared to wild-type LLO was found for the LLOmutant hlyC484S, relating to the latency between toxin application and theregistration of the first pore. This showed that the single cysteine residue in the LLOmolecule attenuates pore formation, possibly by provoking LLO molecules toaccumulate as dimers with reduced pore forming potency. The phenomenon of thiol activation of LLO was also investigated in the present work.The thiol-containing reducing agent dithiothreitol led to a marked increase in poreformation by LLO. This was also observed for the thiol-containing angiotensinconverting-enzyme inhibitor captopril. In contrast, protamine, a thiol-containingpeptide, turned out to be a blocker of LLO-induced pores. In addition, it wasdemonstrated for the first time that protamine itself in higher concentrations caninduce pores. This effect strongly depends on the membrane holding potential. | en |
| dc.language.iso | de_DE | de_DE |
| dc.rights | In Copyright | * |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | * |
| dc.subject.ddc | ddc:610 | de_DE |
| dc.title | Gewinnung und elektrophysiologische Charakterisierung von Listeriolysin O-haltigen Überständen aus Bakterienkulturen von Listeria monocytogenes und ihrer Mutanten | de_DE |
| dc.type | doctoralThesis | de_DE |
| dcterms.dateAccepted | 2008-09-22 | |
| local.affiliation | FB 11 - Medizin | de_DE |
| thesis.level | thesis.doctoral | de_DE |
| local.opus.id | 6472 | |
| local.opus.institute | Rudolf-Buchheim-Institut für Pharmakologie | de_DE |
| local.opus.fachgebiet | Medizin | de_DE |
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