Regulation and pathomechanistic role of matrix metalloproteinases in Idiopathic Pulmonary Fibrosis

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a severe epithelial-fibroblastic disease with poor prognosis, characterised by excessive deposition of collagen in the pulmonary interstitium. Several matrix metalloproteinases (MMPs) and the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) have been demonstrated to be strongly up-regulated in human and experimental lung fibrosis, thus underscoring their dynamic regulation of extracellular matrix and of remodeling processes in the lung. To investigate the spatial regulation, nature of MMP activity and the contribution of TIMPs in the local inhibition of MMPs in IPF, we examined IPF in comparison to donor lung tissue for regulation of MMPs and TIMPs, and the relative contribution of single MMPs to the fibrotic lung repair process. We identified MMP-7 and the collagenases, MMP-1 and -13, as key proteases upregulated in human IPF. A prominent and novel finding of our work is the upregulation of pro- and active MMP-13 protein in IPF patients. MMP-13 protein was localized in alveolar and bronchiolar epithelial cells, the alveolar septae and extracellular matrix of remodelled lung tissue. TIMP proteins were not differentially regulated; an observation that somehow contrasted with the increased hydroxyproline content, especially in the subpleural areas of IPF. We have shown by a combination of immunohistochemistry and in situ zymography that collagenolytic and gelatinolytic activities did not exclusively co-localize with a single MMP antigen signal in the lung tissues, suggesting predominant MMP activity within the airways and weaker activity in the scar regions. Since mice lack the orthologue of human MMP-1, we investigated further the relevance of MMP-13 in the context of fibrotic lung diseases by examining the fibrogenic response to bleomycin in MMP-13-/- mice and wt littermates. In response to bleomycin challenge and likewise to their littermate wt controls, MMP-13-/- mice were characterized by elevated total cell counts in BALF caused largely by an influx of granulocytes and lymphocytes. Seven and fourteen days after bleomycin treatment, both wt and MMP-13-/- mice developed patchy areas of inflammation throughout the lung parenchyma, with MMP-13-/- mice again displaying a more severe inflammatory response to bleomycin that persisted for a longer time period. Likewise, the extent of fibrosis was more prominent in MMP-13-/- versus wt mice, with increased levels of hydroxyproline and more significant histologic signs of fibrosis. It is currently unclear if this augmented fibrotic response was caused by the more extensive inflammation or the absence of MMP-13, especially when considering that MMP-7 was found to be similarly upregulated in both MMP-13-/- and wt mice and the TIMPs were not dramatically altered in MMP-13-/- versus wt mice. In conclusion, in an attempt to define the spatial regulation and the nature of MMP activity in IPF, the contribution of TIMPs in the local inhibition of MMPs and the relative contribution of single MMPs in the process of fibrotic repair in IPF, we could show that (a) TIMPs are not excessively upregulated as compared to MMPs in IPF lungs; (b) the collagenolytic activity of IPF tissue homogenates is higher as compared to donor lungs, thus the increased collagen deposition seems to be largely due to excessive matrix synthesis and deposition rather than blockade of MMPs, (c) collagenolytic and gelatinolytic activities do not colocalize completely with single MMP antigen signals in the lung tissues, suggesting the predominance of MMP activity within the airways and weaker activity in the scar regions (possibly providing one explanation for the process of honeycombing) and (d) MMP-13 seems to play a significant role in IPF, as this collagenase is dramatically upregulated in tissues from IPF patients and as excessive inflammation and fibrosis are encountered in bleomycin challenged MMP-13-/- mice versus control mice lungs. Our data therefore suggest that MMP-13 plays an important, (if not pivotal) role in the remodeling process in IPF, both in view of matrix deposition in the scarring areas, as well as in view of the development of honeycomb cysts, similar to the induction of emphysema formation in MMP-1 overexpressing mice. However, the mechanism of action of MMP-13 together with related mediators remains a subject for further investigation. Die Idiopathische Interstitielle Pneumonie (IPF) ist eine interstitielle Lungenerkrankung, der eine gestörte epitheliale-mesenchymale Interaktion zugrunde liegt, und die aufgrund eines rasch-progredienten und therapierefraktären Verlaufs eine äußerst schlechte Prognose aufweist. Ein Charakteristikum der IPF ist die exzessive Deposition von Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Kollagen. Für verschiedene Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) konnte eine differentielle Regulation bei der Lungenfibrose gezeigt werden, die auf eine dynamische Regulation des Stoffwechsels der Extrazellulärmatrix und auf kontinuierlich ablaufende Umbauprozesse in der Lunge hinweisen. Anhand von Lungengewebe von IPF Patienten wurde in der vorliegenden Arbeit die kompartimentalisierte Regulation der MMPs, die Quelle und Eigenschaften der MMP Aktikivät und die Beteiligung der TIMPs bei der IPF näher untersucht. Darüberhinaus wurde die relative Beteiligung einzelner MMPs am bei der Lungenfibrose gestörten Wundheilungsprozess untersucht. Wir konnten mit MMP-7 und den Kollagenasen MMP-1, MMMP-8 und MMP-13 wichtige Schlüsselenzyme identifizieren, die bei der IPF heraufreguliert sind. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals die gesteigerte Expression von MMP-13 (latentes und aktives Protein) im Lungengewebe von IPF Patienten gezeigt werden. MMP-13 wurde in alveolären und bronchiolären Epithelzellen, in Alveolarsepten und in der extrazellulären Matrix von bereits umgebautem Lungengewebe gefunden. Die MMP Inhibitoren (TIMPs) hingegen zeigten keine differentielle Regulation, ein Befund, der im Widerspruch zu dem vorallem in subpleuralen Gebieten der IPF Lunge- deutlich erhöhten Hydroxyprolin Gehalt steht. Mittels immunhistochemischer Verfahren in Kombination mit in situ Zymograhie konnte gezeigt werden, dass die gelatinolytischen und kollagenolytischen Aktivitäten nicht zwangweise mit einzelnen MMP Antigensignalen im Lungengewebe kolokalisiert waren; die prädominante MMP Aktivität wurde in den Atemwegen detektiert, in den fibrotischen Herden hingegen zeigte sich eine schwächere Aktivität. Da orthologe knockout Mäuse für humane MMP-1 nicht verfügbar waren, lag der weitere Focus auf der Untersuchung der Rolle von MMP-13 bei der Fibroseentwicklung am Modell der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose unter Verwendung vom MMP-13 knockout Mäusen. Hinsichtlich der Zahl und der prozentualen Zusammensetzung lavagierbarer Zellen im alveolären Kompartiment. zeigte sich sowohl bei MMP-13-/- wie auch bei Wildtyp Mäusen ein Anstieg der Gesamtzellzahl, der auf einen Einstrom von Granulozyten und Lymphozyten in den Alveolarraum zurückzuführen war. An Tag 7 und Tag 14 nach Bleomycinapplikation war histologisch bei beiden Mäusen eine Entzündungsreaktion des Lungenparenchyms mit unregelmäßigem Verteilungsmuster festzustellen, das bei den MMP-13-/- Tieren jedoch stärker ausgeprägt war und über einen längeren Zeitraum bestand hatte. Dabei zeigten die Septen der Knockout Tiere eine stärkere Infiltration mit granulozytären und lymphozytären Zellen, mit einer Akzentuierung subpleuraler und peribronchiolärer Areale. Derzeit ist allerdings unklar inwieweit die verstärkt ablaufende Fibroseantwort auf die gesteigerte Inflammationsreaktion oder das Fehlen von MMP-13 zurückzuführen ist, insbesondere wenn man berücksichtigt, dass MMP-7 sowohl in MMP-13 -/- wie auch Wildtyp-Mäusen heraufreguliert war und die TIMPs in MMP-13 -/- im Vergleich zu Wildtyp Tieren nicht substantiell verändert waren. Die wichtigsten Befunde dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: (a) im Gegensatz zu MMPs werden deren Inhibitoren (TIMPs) in Lungen von IPF Patienten nicht überhöht exprimiert. (b) die kollagenolytische Aktivität im Homogenat von IPF Lungen ist höher als in Homogenaten von Donorlungen. Die erhöhte Kollagendeposition scheint daher eher durch eine überhöhte Synthese von Komponenten der extrazellulären Matrix als durch die Inhibition der Degradation (MMP Inhibition) zustande zukommen. (c) die kollagenolytischen und gelatinolytischen Aktivitäten sind nicht zwingend mit dem Antigensignal einzelner MMPs co-lokalisiert, was eine Prädominanz der MMP Aktivität in den Atemwegen und eine geringere Aktivität in den fibrotischen Arealen vermuten lässt, und somit eine mögliche Erklärung für den Umbau zur Honigwabenlunge (honeycombing) liefert. (d) die erhebliche Überexpression von MMP-13 in IPF Lungen und die gesteigerte Fibroseantwort bei MMP-13 knockout Mäusen nach Bleomycin Schädigung legt nahe, dass diese Kollagenase eine wichtige Rolle bei der Fibroseentwicklung spielt. Die hier gezeigten Daten belegen, dass MMP-13 eine wichtige, wenn nicht sogar eine Schlüsselrolle bei den Umbauprozessen im Rahmen einer IPF einnimmt, und zwar sowohl was die Deposition von Extrazellulärmatrix in den Fibroseherden betrifft, wie auch im Hinblick auf die Bildung der Honigwaben Zysten (analog zur Induktion der Emphysembildung bei MMP-1 überexprimierenden Mäusen). Zur Aufklärung der Mechanismen, über die die MMP-13 Effekte vermittelt werden, sowie zur Identifizierung der beteiligten Mediatoren müssen weiterführende Studien durchgeführt werden.