Experimentelle Untersuchung zur Obstruktion der ableitenden Samenwege beim Kaninchen : Einfluß der Obstruktion auf Ejakulatparameter, Hodenmorphologie und Expression verschiedener Kernproteine in den Keimzellen

Abstract

Die freiwillige Sterilisation des Mannes mittels Vasektomie stellt heute eine weit verbreitete Methode zur Schwangerschaftsverhütung dar. Etwa 6% aller vasektomierten Männer lassen sich nach einer gewisser Zeit refertilisieren. Neben der einfachen Wiederherstellung der Durchgängigkeit der ableitenden Samenwege (Vasovasostomie) steht die operative Spermatozoenentnahme für ICSI zur Verfügung. Dabei stellt sich die Frage zur Qualität der Spermatozoen und ihrer Befruchtungsfähigkeit nach langzeitiger Obstruktion. Ein Aspekt dieses Problems ist die Kondensierung des DNA Materials in den Spermatozoen und dessen Störungen unter dem Einfluß verschiedener Faktoren. Es ist bekannt, dass Spermatozoen mit gestörter Chromatinkondensierung bei ICSI und IVF schlechter fertilisieren. Die Chromatinkondensierung bei den testikulären und epididymalen Spermatozoen ist Ergebnis eines komplizierten Prozesses von Austausch verschiedener Kernproteine im Keimepithel während der Spermatogenese. Dabei werden die testis spezifischen Histone durch Transitionsproteine ausgetauscht, später werden beide Transitionsproteine gegen Protamine ersetzt. Dieser Prozess findet in den runden und elongierten Spermatiden statt. Ziel unserer tierexperimentellen Arbeit war es festzustellen, ob eine Obstruktion der ableitenden Samenwege Veränderungen in der Chromatinkondensierung bei testikulären und epididymalen Spermatozoen und in der Expression des Transitionsproteins 1 und der Protamine 1 und 2 verursacht. Weiterhin sollte geklärt werden, ob die Nebenhodenpassage die Chromatinkondensierung der Spermatozoen beeinflusst. Dazu wurden 7 männliche Kaninchen beidseitig vasektomiert, 7 einseitig, 9 Kaninchen wurden als Kontrolle benutzt. Alle Tiere hatten normale Ejakulatparameter. 6 Monate nach der Vasektomie folgte die Organentnahme und die entsprechende Untersuchungen wurden durchgeführt. Die Chromatinkondensierung wurde mittels Anilinblau Färbung untersucht, die mRNA Expression von TP 1, PRM 1 und PRM 2 wurde mittels In situ Hybridisierung nachgewiesen. Die 6-monatige Obstruktion verursachte eine deutliche Stauung des Nebenhodens im Bereich des Schwanzes, eine zunehmende Spermatozoendichte im Nebenhodenschwanz, eine abnehmende Dichte in den anderen beiden Kompartimeneten des Nebenhodens, sowie eine Reduktion der Spermatozoenmotilität. Die Anzahl der Spermatozoen mit dem komplett kondensierten DNA Material war signifikant höher im Nebenhodenschwanz im Vergleich mit den Nebenhodenkopf und Hoden. Das galt für alle drei Gruppen. Der Vergleich zwischen den vasektomierten und nicht vasektomierten Hoden und Nebenhoden brachte folgendes Ergebnis für die vasektomierte Tiere: eine signifikant höhere Anzahl der Spermatozoen im Hoden und im Nebenhodenkopf, kein Unterschied im epididymalen Corpus und einen signifikant niedrigeren Anteil im Nebenhodenschwanz im Vergleich mit der Kontrolle. Die 6-monatige Obstruktion der ableitenden Samenwege verursachte verschiedene Veränderungen in der Hodenmorphologie. Die häufigste Störungen, die beobachtet wurden, waren eine Degeneration des Keimepithels und ein Spermatogenesearrest. Aber nicht alle obstruierte Hoden wiesen den gleichen Grad der Veränderungen auf, die Morphologie blieb bei manchen Hoden erhalten. Es wurde keine Spermatogenese beobachtet, was mit der äußerst geringeren Spermatozoendichte im Nebenhodenkopf übereinstimmt. Zusammenfassend sind die morphologischen Veränderungen im vasektomierten Hoden in unserer Arbeit nicht einheitlich. Die Expressionsmuster von TP 1-mRNA, PRM 1-mRNA und PRM 2-mRNA blieb nach der Obstruktion unverändert. Es wurden große quantitative Schwankungen beobachtet. Aim of the study: The maturity of spermatozoa and more specifically condensation of their DNA-material can influence ICSI-outcomes; germ cells with disturbances of the chromatin packaging have poor fertilization capacity. Testicular (TESE) and epididymal (MESA) spermatozoa in men after vasectomy are available for ICSI. In order to investigate how condensation of the DNA-material is altered in the different locations in the male reproductive tract under obstructive and non-obstructive conditions and how vasectomy influences chromatin condensation, we have established an experimental animal model of obstructive azoospermia. Material and methods: 23 New Zealand white male rabbits were vasectomized unilateral (7 animals) and bilateral (7 animals). A group of 9 rabbits with normal spermatogenesis were used as control. 6 months after vasectomy testes and epididymes of all animals were removed; spermatozoa were obtained from caput, corpus and cauda epididymis and also from the testis. Testicular tissue samples were taken for histological investigation and in-situ hybridization. Chromatin condensation in testicular and epididymal spermatozoa were determined with aniline blue staining and classified according to Henkel et al. (1994). The histone-to-protamine replacement in the round and elongated spermatids during spermatogenesis is responsible for the final shape and condensation of the DNA-material in the mature spermatozoa. Expression of transition protein 1 and protamine 1 and 2 in round and elongated spermatids, assessed by in-situ hybridization, indicates normal and abnormal status of chromatin condensation. Results: Significant higher (p< 0.01) percentage of spermatozoa with completely condensed DNA-material in comparison with these in the testis were found in non-obstructive cauda epididymis. Similar is the situation in the obstructive testis-epididymis complex. The comparison between obstructive and non-obstructive units showed statistically significant differences only in the cauda epididymis. Various alterations were found in the morphology of the vasectomized testes from intact spermatogenesis up to spermatogenesis arrest at different stages. We have found unchanged expression of transition protein 1 and protamine 1 and 2 in the testes where round and elongated spermatids were presented. Conclusion: Our experimental model showed that cauda epididymis represents a suitable location for obtaining spermatozoa for ICSI; obstruction could influence the distribution of spermatozoa with completely condensed DNA-material. Vasectomy causes alterations on the testis morphology, but the process of condensation of the DNA-material remains undisturbed.