Molecular programs induced in alveolar resident and recruited mononuclear phagocytes by Toll-like receptor 2/4 agonists

Abstract

Mononuclear phagocytes play a pivotal role in lung host defence to inhaled pathogens by activation of both innate and adaptive immunity. Resident alveolar macrophages (AMs) are the primary mononuclear phagocytic cells found in the lower respiratory tract that play a central role in regulating pulmonary immune responses. Circulating mononuclear phagocytes (MPs) recruited into inflamed lungs, however are increasingly implicated as essential players in defence against a range of inhaled pathogens. To further elucidate the function of mononuclear phagocytes in regulating pulmonary immune responses we analysed molecular programs induced by bacterial ligands that are recognized by different TLRs. First, we discovered that TLR2 ligand Pam3CSK4 and TLR4 ligand LPS induced in AMs the expression of PKR, previously identified as an essential component of the innate antiviral response. More important we found that both TLR2 and TLR4 agonists induced rapid phosphorylation of PKR strictly dependent on the functionality of the respective TLR. Pharmacologic inhibition of PKR activity using 2-aminopurine (2-AP) and PKR gene deletion were found to reduce the TLR2/4-induced activation of the JNK signalling pathway (MKK4/JNK/c-Jun), but did not affect p38 and ERK1/2 activation. Moreover, inhibition of PKR phosphorylation severely impaired TNF-alpha and IL-6 production by AMs in response to LPS and Pam3CSK4. Additionally, we found that PKR phosphorylation plays a major role in LPS but not Pam3CSK4-induced activation of the p65 subunit of NF-kappaB. Collectively, these results indicate that functional PKR is critically involved in inflammatory responses of primary AMs to gram-positive as well as gram-negative bacteria cell wall components. In addition, we investigated the induction of lung inflammation and the concomitant MP recruitment after alveolar deposition of the TLR2 ligand Pam3CSK4. By using cell sorting, mRNA pre-amplification and whole genome oligonucleotide microarray techniques we found that alveolar trafficking of MPs was associated with profound changes of their gene expression profiles post recruitment (~2500 genes increased). In particular, alveolar recruited MPs showed strong up-regulation for genes encoding cytokines/chemokines, PRR associated molecules and genes involved in eicosanoid metabolism. Interestingly, gene expression profiling revealed that lung recruited MPs displayed simultaneous induction of both pro- and anti-inflammatory genes. However, we observed a dynamic change of the genetic program of MPs found in BALF at different time intervals post challenge. Strong early induction of a subset of pro-inflammatory mediators such as TNF-alpha, CCL2 and IL-6 was found to decrease during the later resolution phase whereas increased transcript levels of central anti-inflammatory and pro-resolution mediators including IL-1RN, IRAK-M, IL-10 and BAX persisted at the same levels. Collectively, our in vivo study identifies for the first time the global genetic program activated in MPs at different time points during TLR2 ligand-induced recruitment to the alveolar space and thus may help to better understand how alveolar recruited MPS may contribute to the development and termination of pneumonia caused by gram-positive bacteria. Mononukleäre Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunabwehr von inhalierten Pathogenen. Alveolarmakrophagen (AM) stehen dabei an vorderster Front und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der pulmonalen Immunantwort. Darüber hinaus wird in der letzten Zeit zunehmend klar, dass auch Monozyten, die aus dem Gefäßbett in das entzündete Lungengewebe einwandern, eine wesentliche Rolle in der Wirtsabwehr pulmonaler Infektionen spielen. Um die Rolle der residenten und rekrutierten mononukleären Zellpopulationen im Rahmen der pulmonalen Immunabwehr genauer zu untersuchen, analysierten wir Signaltransduktions-Kaskaden, die durch Pathogen-assoziierte Gefahrensignale über verschiedene Toll-like Rezeptoren in diesen Zellen induziert werden. Hierbei zeigte sich, dass Pam3CSK4 über TLR2 und LPS über TLR4 in AMs die Expression des Enzyms PKR induziert, das bislang als wichtige Komponente der angeborenen antiviralen Immunität bekannt war. Außerdem führt die Aktivierung von TLR2/4 zu einer sehr schnellen Phosphorylierung von PKR, was die Aktivierung nachgeschalteter Signaltransduktions-Kaskaden entscheidend mitbestimmt. So reduzierte die Inhibierung der PKR durch 2-Aminopurin (2-AP) oder die Gendeletion des PKR-Gens die TLR2/4-induzierte Aktivierung des JNK-Signalweges (MKK4/JNK/c-Jun). Im Gegensatz dazu erfolgte keine Inhibition der p38 und ERK1/2 Aktivierung. Darüber hinaus führte eine Inhibition der PKR-Phosphorylierung zu einer starken Hemmung der TNF-alpha und IL-6-Produktion der AMs nach LPS- und Pam3CSK4-Stimulation. Außerdem konnten wir zeigen, dass die PKR-Phosphorylierung eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung der LPS-induzierten, nicht jedoch der Pam3CSK4-induzierten Aktivierung der p65 Untereinheit von NF-kappaB spielt. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse die Vermutung nahe, dass PKR eine kritische Rolle bei der durch Zellwandbestandteile gram-positiver und negativer Bakterien induzierten inflammatorischen Antwort von Alveolarmakrophagen spielt.In einem zweiten Ansatz untersuchten wir Mechanismen der Induktion einer pulmonalen Entzündungs-Reaktion und der nachfolgenden Einwanderung von Blut-Monozyten nach alveolärer Deposition des TLR2-Liganden Pam3CSK4. Wir kombinierten Zellsorting, mRNA-Präamplifikation und Gesamtgenom-Microarray Technologien, um Veränderungen des globalen genetischen Programms von Monozyten bei Einwanderung in den Alveolarraum zu untersuchen. Hierbei fanden sich tief greifende Veränderungen der Genexpression in den mononukleären Phagozyten nach alveolärer Rekrutierung, wobei die Expression von ca. 2500 Genen signifikant erhöht war. Im Einzelnen konnten wir eine Erhöhung der Expression von Genen der Cytokin-und Chemokin-Familien, Pattern-Recognition-Rezeptoren sowie Eiconsanoid-metabolisierenden Enzyme nachweisen. Dabei wurde interessanter Weise sowohl die Transkription pro- als auch antiinflammatorischer Gene induziert. Allerdings zeigten mononukleäre Phagozyten, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Pam3CSK4-induzierter Rekrutierung analysiert wurden, deutliche Unterschiede in ihrem Genexpressionsprofil: mRNA Spiegel von pro-inflammatorischen Mediatoren wie TNF-alpha, CCL2 und IL-6 waren zu frühen Zeitpunkten stark erhöht und sanken dann rasch ab, während die ebenfalls bereits früh erhöhte Genexpression von zentralen anti-inflammatorischen Mediatoren wie IL-1RN, IRAK-M, IL-10 und BAX auch zu späteren Zeitpunkten persistierte. Zusammenfassend erfassen diese Untersuchungen zum ersten Mal detailliert das globale genetische Programm aktivierter mononukleärer Phagozyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TLR2-Ligand-induzierter Rekrutierung in den Alveolar-Raum. Dies erlaubt einen Einblick in das Funktionsrepertoire von mononukleären Phagozyten, mit dem diese zur pulmonalen Entzündungsinduktion und terminierung bei durch gram-positive Bakterien hervorgerufenen Pneumonien beitragen können.