Methodik zur dreidimensionalen Darstellung und morphometrischen Analyse der terminalen Lufträume der Lunge in der Mikro-Computertomographie

Abstract

Die Histologie stellt den Goldstandard bei der Darstellung und Analyse des Lungengewebes dar. Aus der mechanisch-destruktiven Gewebepräparation resultieren Artefake und eine Probenzerstörung. Auch gelingt nur eine indirekte Erfassung der dritten Dimension aus 2D-Schnitten. Radiologische Techniken besitzen demgegenüber den Vorteil einer nichtdestruktiven Abbildung. Limitierend war bislang die Auflösung, welche keine Visualisierung der Alveolen ermöglichte. Die Technik der Mikro-CT erlaubt eine nichtdestruktive und hochauflösende, kontinuierliche Untersuchung kleiner Proben. Grundsätzlich ist ein Erhalt der Alveolararchitektur aufgrund der Forminstabilität und Elastizität der Lunge schwierig. Auch besitzen die dünnen Alveolarwände keinen ausreichenden Röntgenkontrast. Ziel war die Entwicklung einer Methodik zur Darstellung und morphometrischen Analyse der pulmonalen Mikrostrukturen in der Mikro-CT.Fünf linke Schweinelungen und eine humane Lunge werden durch Formalindampfbeatmung in Inspirationslage fixiert. Nach Schneiden in Scheiben werden subpleurale Gewebezylinder entnommen (Durchmesser 8 mm, Höhe 10 mm). Diese werden einer Osmiumtetroxid-Kontrastierung, chemischen Entwässerung und Kritisch-Punkt-Trocknung unterzogen. Im Mikrotomographen werden von jeder Probe 900 Querschnittsbilder des Lungengewebes bei einer Auflösung von 18 µm generiert. Die isotropen Datensätze (9 µm Voxelgröße) bilden die Grundlage für zwei- und dreidimensionale Rekonstruktionen. Nach dem Scannen werden die Proben zusätzlich histologisch aufgearbeitet und 8 µm dicke Serienschnitte angefertigt. Basierend auf etablierten stereologischen Techniken erfolgt die quantitative Untersuchung der Alveolen in mikrotomographischen und histologischen Schnittbildern. Zudem werden basierend auf den Volumendatensätzen der Mikro-CT Strukturparameter mittels einer semiautomatischen Analysesoftware gewonnen. Die Übereinstimmung der Methoden wird mittels Regressions- und Bland-Altman-Analyse geprüft.Mit der Formalindampffixierung und dem Einsatz elektronenmikroskopischer Techniken gelingt ein optimaler Strukturerhalt mit homogen kontrastierten und vollständig getrockneten, luftgefüllten Lungenzylindern. Die Mikro-CT ermöglicht eine der Lichtmikroskopie vergleichbare Darstellung bis zu den einzelnen Alveolen. Beim Bildpaarvergleich Histologie - Mikro-CT zeigt sich eine hohe Übereinstimmung. In der nichtdestruktiven Mikro-CT treten bei nur 2,1 % der Schnittbilder Aufhärtungsartefakte auf. Demgegenüber weisen präparationsbedingt 66,5 % der histologischen Schnitte strukturelle Gewebealterationen auf. Zur Abschätzung des Einflusses der unterschiedlichen Präparationen werden die am mikrotomographischen und histologischen Schnitt auf stereologischer Basis ermittelten Werte alveoläre Oberflächendichte und Alveolardurchmesser verglichen. Die Werte für die alveoläre Oberflächendichte (33,47±1,91 /mm bzw. 35,47±2,4 /mm) differieren signifikant zwischen mikrotomographischen und histologischen Schnittbildern mit konstant niedrigeren Werten in der Mikro-CT (Korrelation r=0,72; p=0,018); die Übereinstimmung im Bland-Altman-Plot beträgt 2±1,6 /mm. Die Werte für den mittleren Alveolardurchmesser (135,8±15,0 µm bzw. 135,7±14,5 µm) differieren demgegenüber nicht signifikant bei guter Korrelation (r=0,97; p<0,0001), die Übereinstimmung im Bland-Altman-Plot beträgt -0,1±3,4 µm.Mittels semiautomatischer Analyse werden Gewebevolumen und alveoläre Oberfläche direkt bestimmt. Aus diesen Parametern lassen sich die alveoläre Oberflächendichte (30,49±0,95 /mm) und der Alveolardurchmesser (134,4±13,6 µm) sekundär berechnen. Zur Abschätzung der Genauigkeit der semiautomatischen Analyse werden diese Werte mit den stereologiebasierten Werten der mikrotomographischen Schnitte verglichen. Dabei differieren die Werte für die alveoläre Oberflächendichte signifikant innerhalb desselben Messvolumens mit konstant niedrigeren Werten in der semiautomatischen Analyse. Die Korrelation beträgt r=0,70 (p=0,023), die Übereinstimmung im Bland-Altman-Plot 2,9±1,4 /mm. Demgegenüber differiert der mittlere Alveolardurchmesser nicht signifikant bei guter Korrelation (r=0,97; p<0,0001), die Übereinstimmung im Bland-Altman-Plot beträgt 1,4±3,3 µm.Auflösungsbedingt ergibt sich bei der mikrotomographischen Analyse ein Gewebeverlust. Dieser erklärt sich über den Partialvolumeneffekt bei der Binärbilderzeugung und Segmentation mit konsekutiv geringeren Werten für die Alveolaroberfläche.Die isotropen Datenätze optimieren zwei- und dreidimensionale Rekonstruktionen des Lungengewebes. Es gelingt die dreidimensionale Rekonstruktion des Acinus.Die Methodik konnte auf humane Lungen übertragen werden. Ziel weiterer Arbeiten ist die Untersuchung pulmonaler Krankheitsentitäten wie Lungenemphysem und Fibrose. Die Präparationstechnik in Verbund mit der vorgestellten Bildgebung ist als Methodik geeignet, weitere Untersuchungen der Architektur des Alveolarraums voranzutreiben.